0 次观看 • 5:10 分钟 • July 8th, 2025
用测试试剂处理产脓黑色素和非产脓黑色素的细菌菌株。
吡咯黑素是一种胞外色素，可提供对抗氧化应激的保护作用。
测试试剂会破坏吡咯黑素的生物合成，从而减少其生成。
孵育结束后，使用含有待测试剂或溶剂对照的缓冲液进行细菌的系列稀释。
将细菌稀释液点种到含有不同过氧化氢浓度（一种氧化应激剂）的琼脂平板上。
不含过氧化氢的平板作为对照。
孵育。在对照平板上，细菌形成菌落。
在未经处理的产绿脓菌素菌株中，绿脓菌素可保护细菌免受过氧化氢引起的氧化损伤，从而形成有色素的菌落。
然而，经测试试剂处理的产吡咯黑素菌株，其吡咯黑素产量降低，对氧化应激变得敏感，从而导致细菌死亡。
计数菌落。
与对照组相比，经处理的产脓色素菌株以及经处理和未经处理的非产脓色素菌株在过氧化氢浓度增加时菌落数量减少、菌落尺寸变小，表明细菌对氧化应激的敏感性增强。
开始此实验步骤时，需在含有和不含 NTBC 的 LB 培养基中接种待测菌株，并进行过夜培养。第二天，制备含有过氧化氢的 LB 琼脂平板，以施加氧化应激压力。首先，在室温下将 LB 琼脂培养基融化，并冷却至约 50 摄氏度。
接下来，将过氧化氢直接加入已冷却的培养基中，达到所需浓度。轻轻摇动烧瓶以混匀。建议起始浓度范围为 0 至 1 毫摩尔。立即倒入培养皿，并用火焰灼烧表面以去除气泡。每 100 毫米 LB 琼脂可制备四个平板。用记号笔标注各平板上的过氧化氢浓度。
将平板置于生物安全柜中，打开盖子并开启风扇，吹干30分钟，以去除平板表面多余的水分。平板应在制备当天使用。在平板干燥的同时，洗涤并测定过夜培养物的OD600值。
将所有过夜培养物的OD600调整至待测菌株组中最低的OD600值。为此，计算在总体积为1毫升时，将培养物稀释至最低OD600所需的培养物体积。
例如，如果某菌液的 OD600 为 3，而该组菌株中最低的 OD600 为 2.5，则进行如下计算，得到所需菌液体积为 0.833 毫升。取 0.833 毫升菌液置于微量离心管中。接着，计算需要加入的 LB 培养基加 NTBC 或 LB 培养基加 DMSO 的体积，以使总体积达到 1 毫升。在本例中，该体积为 0.167 毫升。通过涡旋振荡混合均匀。
为了在恒定浓度的NTBC或DMSO中维持培养物，用含NTBC的PBS或含DMSO的PBS对过夜培养物进行10倍系列稀释。根据所测试菌株的数量，配制相应体积的含NTBC的PBS和含DMSO的PBS储备液。
针对一个菌株的一组稀释液，将300微摩尔的NTBC或等体积的DMSO与PBS混合，总体积为720微升。向标记为10⁻¹至10⁻⁷梯度稀释的相应微量离心管中加入90微升PBS加NTBC或PBS加DMSO。向相应的10⁻¹稀释管中加入10微升菌液。
涡旋混匀，取10微升10⁻¹稀释液转移至10⁻²稀释管中。每次稀释均需更换移液器吸头，重复操作直至完成所有稀释步骤。
将每种菌株的10⁻³至10⁻⁷稀释液分别取5 µL，每种稀释度设两个重复，点种于含过氧化氢的LB平板上。若按从最稀释到最浓缩的顺序点样，可使用同一个移液器枪头。在液体完全被平板吸收前，切勿晃动或倾斜平板。将平板置于37°C培养，时间根据菌株不同为24至48小时。待出现大小合适的菌落时，使用位于透射光源上方的CCD相机拍摄平板图像。