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免疫学
0 次观看 • 6:41 分钟 • July 8th, 2025
取一个带有盖子的微量滴定板，盖子上带有圆柱形支撑物或小柱，其表面涂有细菌生物膜。
将带有生物膜的 peg-lid 置于含缓冲液的微量滴定板孔中，以去除松散附着或浮游的细菌，重点进行生物膜附着的测量。
将冲洗后的带有生物膜的 peg-lid 转移至含有梯度增加的测试抗菌剂浓度的挑战平板中。在不振荡的条件下孵育。
根据药物的浓度及其抗菌潜力，它会破坏细菌的代谢活性和生物膜的完整性。
孵育结束后，将含有缓冲液的孔板上的盖板（peg lid）放入孔中，以去除浮游细菌。
将其转移至含有刃天青（resazurin）的微量滴定板孔中，该孔内培养基为可穿透细胞的弱荧光染料，用于生物膜回收。孵育。
在代谢活跃的细菌中，脱氢酶可将蓝色的刃天青还原为粉红色、具有荧光的羟基刃天青。
若无刃天青转化，表明生物膜已被根除；若转化为羟基刃天青，则提示存在活细胞。
显示无刃天青（resazurin）转化的最低测试抗菌剂浓度即为最小生物膜清除浓度。
取一个新的96孔板，向B至H行的每孔中加入100微升已平衡至室温的CRPMI培养基。将最多四种待测化合物分别用1.0毫升CRPMI培养基稀释至目标终浓度的2倍。在A1至A3孔中加入200微升化合物一，在A4至A6孔中加入200微升化合物二，在A7至A9孔中加入200微升化合物三，在A10至A12孔中加入200微升化合物四。
使用多通道移液器对测试化合物进行连续稀释。首先将100微升液体从A行转移至B行，并混匀。以此方式逐孔转移100微升液体，每次转移后均需混匀，直至F行。混匀后，将F行中的100微升液体排入废液容器中。不要向G行和H行转移任何液体。最后，使用多通道移液器向每孔加入100微升CRPMI，使最终体积达到200微升。
向一个新的无菌96孔板中加入200微升磷酸盐缓冲液，该孔板的孔尺寸需与生物膜起始板的孔尺寸相同。接着，从孵育后的生物膜起始板上移除塑料袋和石蜡膜。垂直向上提起盖子，避免盖上的钉状突起与板底接触，以免损坏生物膜。保留底部板用于后续的OD600分析。
通过将带有悬垂柱的盖子放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的孔板中，冲洗掉浮游细胞。将悬垂柱浸入PBS中5秒，取出后再重新浸入一次，注意不要让悬垂柱碰到孔壁。将冲洗后的带柱盖子放入挑战孔板中。避免悬垂柱与底板之间发生不必要的接触，以免破坏生物膜，导致结果不一致。
用石蜡膜密封培养板，并如前所述放入可密封的塑料袋中。将培养板置于含5%二氧化碳的培养箱中，于37°C静置培养24小时。取生物膜起始培养板的底部，使用多通道移液器重悬各孔中的细菌。使用合适的酶标仪测定OD600，以确认所有孔中均有细菌生长，但H行的无菌对照孔除外。
使用配备有孵育室且能够进行动力学荧光检测以检测刃天青还原的酶标仪。设置持续24小时的动力学荧光测定程序，激发波长为530纳米，发射波长为590纳米。将孵育室温度设为37摄氏度，并每20分钟读取一次酶标板。
根据制造商的说明，将酶标仪设置为从培养板底部进行检测。使用多通道移液器向无菌96孔板的每个孔中加入200 µL PBS，以准备洗涤培养板。然后，通过将400 µL浓度为0.8 mg/mL的刃天青储备液加入20 mL CRPMI培养基中，制备生物膜恢复培养基，使刃天青的终浓度为16 µg/mL。
接下来，使用多通道移液器向一个新的96孔板的每个孔中加入150微升生物膜回收液。将挑战板从培养箱转移至生物安全柜中，小心移去塑料袋和封口膜。取下挑战板的 peg 盖，用 PBS 冲洗浮游细胞，如同之前操作，保留挑战板底部用于后续的 OD600 分析。
冲洗后，将插针盖放入含有生物膜回收培养基的板底中。用封口膜包裹板的四周，注意不要遮挡周边孔的底部。包裹完毕后立即将板放入酶标仪中，并启动之前设定好的刃天青动力学检测程序，开始持续24小时的动力学读数。