一种基于体外荧光的测定法,用于测量质膜再密封效率

0 views • 4:34 min • July 8th, 2025

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在冰上取一个含有哺乳动物细胞的微孔板。

向选定的孔中加入含钙的培养基,向其他孔中加入不含钙的培养基。

引入细菌成孔毒素的单体。低温可防止单体聚集,促进与细胞膜胆固醇的结合。

生理温度下孵育,使胆固醇结合的单体寡聚并插入膜中,形成孔。

在含有细胞外钙的孔中,孔隙会导致钙流入。

流入

会触发毒素的外泌体脱落和膜重新密封。

细胞内钙的增加还诱导溶酶体胞吐作用,释放一种酶,将膜的鞘磷脂转化为神经酰胺。

富含神经酰胺的膜引发毒素内吞作用,重新密封膜。

在没有细胞外钙的孔中,膜重新密封受到阻碍。

添加碘化丙啶或 PI(一种荧光染料),它不能进入具有修复膜的细胞,但会进入受损细胞结合 DNA,发出荧光。

以规定的时间间隔测量荧光以评估膜重封效率。

为了为修复允许条件建立基于高通量荧光的测定,每孔用200微升37摄氏度M1培养基洗涤细胞两次,并在丢弃第二次洗涤后加入100微升新鲜的37摄氏度M1培养基,并补充有30微摩尔碘化丙啶。

对于修复限制性条件,每孔用200微升37摄氏度的M2培养基洗涤细胞一次,每孔补充5毫摩尔EGTA的细胞,然后单独用200微升M2培养基洗涤一次。

弃第二次洗涤后,每孔加入100微升新鲜的37摄氏度M2培养基,补充有30微摩尔碘化丙啶。然后,如刚才所示,在透射光、GFP 和 PI 下对板进行成像。在对板进行成像时,将 96 孔圆底聚丙烯微孔板放在冰上,并按照刚才为前一个板演示的配置板。

对于修复允许条件,每孔添加 100 微升补充有 60 微摩尔碘化丙啶的冰冷 M1 培养基,然后每孔添加 100 微升冰冷 M1,含或不含 4x 李斯特菌溶素 O。

对于修复限制性条件,每孔加入100微升补充有60微摩尔碘化丙啶的冰冷M2培养基,然后每孔加入100微升冰冷M2,含或不含4x李斯特菌溶血素O。

板1在冰上并且正在制备板2时,必须在动力学测定开始前约5分钟在冰上制备适当的实验浓度李斯特菌溶素O。

当第一块板完成成像后,立即将板转移到冰上的铝箔上。5分钟后,将100微升从第二个板的每个孔转移到第一个冷却板中适当的相应孔中,将移液器吸头插入每个孔中溶液弯月面下方,然后弹出体积而不混合以正确分布毒素。

让毒素与宿主细胞结合1分钟,并立即将第一个板转移到酶标仪上,使用荧光光谱仪模式进行动力学后测定。在动力学测定结束时,立即获得板图像的运动后成像,如动力前成像所示。

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Last updated: 4 July 2026