0 次观看 • 4:34 分钟 • July 8th, 2025
将含有哺乳动物细胞的微孔板置于冰上。
向选定的孔中加入含钙的培养基，向其余孔中加入不含钙的培养基。
引入细菌成孔毒素的单体。低温可防止单体聚集，有利于其与细胞膜胆固醇结合。
在生理温度下孵育，使结合胆固醇的单体发生寡聚化并插入膜中，形成孔道。
在含有细胞外钙的孔板中，孔道引起钙离子内流。
这种内流会触发外泌体释放毒素并实现膜的重新封闭。
细胞内钙离子浓度的升高还会诱导溶酶体胞吐作用，释放一种将细胞膜上的鞘磷脂转化为神经酰胺的酶。
富含神经酰胺的膜触发毒素的内吞作用，从而重新封闭细胞膜。
缺乏细胞外钙时，细胞膜的重新封闭受到阻碍。
加入碘化丙啶（propidium iodide）或 PI — 一种荧光染料 — 该染料无法进入细胞膜已修复的细胞，但可进入膜受损的细胞并与 DNA 结合，从而发出荧光。
在规定时间间隔内测量荧光，以评估膜修复效率。
为了建立基于荧光的高通量修复许可条件检测，每孔用 200 微升 37 摄氏度的 M1 培养基洗涤细胞两次，在弃去第二次洗涤液后，加入 100 微升新鲜的 37 摄氏度 M1 培养基，并补充 30 微摩尔的碘化丙啶。
对于修复限制性条件，每孔先用200微升添加了5毫摩尔EGTA的37摄氏度M2培养基洗涤细胞一次，随后再用200微升M2培养基单独洗涤一次。
弃去第二次洗涤液后，每孔加入 100 微升新鲜的 37 摄氏度 M2 培养基，其中添加 30 微摩尔/升碘化丙啶。然后，按照前述方法在透射光、GFP 和 PI 下对培养板进行成像。在成像过程中，将一个 96 孔圆底聚丙烯微量培养板置于冰上，并按照前述方法对培养板进行配置。
在修复许可条件下，每孔加入 100 微升含 60 微摩尔碘化丙啶的冰冻 M1 培养基，随后每孔加入 100 微升含或不含 4 倍李斯特菌溶血素 O 的冰冻 M1 培养基。
对于修复限制性条件，每孔加入100微升冰冻的M2培养基，其中添加60微摩尔的碘化丙啶，随后每孔加入100微升冰冻的M2培养基，可选择性添加或不添加4倍浓度的单增李斯特菌溶血素O。
必须在冰上将李斯特溶血素 O 配制为适当的实验浓度，时间大约在动力学检测开始前 5 分钟，此时 1 号板置于冰上，同时正在准备 2 号板。
第一块培养板成像结束后，立即将其转移至置于冰上的铝箔片上。5分钟后，从第二块培养板的每个孔中吸取100微升溶液，加入第一块已冷却培养板相应的对应孔中，加样时将移液枪头插入目标孔溶液的弯月面以下再排出液体，不进行混匀，以确保毒素的均匀分布。
让毒素与宿主细胞结合1分钟，立即将第一块培养板转移至酶标仪，使用荧光分光光度模式进行动力学后检测。在动力学检测结束后，立即对培养板进行动力学后成像，成像方法参照动力学前成像所示操作。