一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学染色方法

从一张载有福尔马林固定、石蜡包埋的狂犬病病毒感染小鼠脑组织切片的玻片开始。这种固定切片通过蛋白质交联保留了病毒抗原。

用二甲苯溶液处理载玻片以去除石蜡。

将载玻片浸入浓度递减的乙醇溶液中，以使组织复水，从而使其与水溶液相容。

加入含有蛋白酶的缓冲液以破坏蛋白质交联，提高抗原的可及性。

用过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶，并加入封闭液以防止非特异性结合。

加入针对狂犬病抗原的特异性一抗，形成抗原-抗体复合物。

加入与一抗结合的生物素标记的二抗。再与生物素结合的链霉亲和素-过氧化物酶偶联物孵育。

加入过氧化物酶底物，产生品红色沉淀。

使用核染色剂对组织进行复染，随后使用蓝化剂，使细胞核呈蓝色。

免疫组织化学图像显示细胞质中存在紫红色斑点，证实了组织切片中存在狂犬病抗原。

使用切片机制作5微米厚的石蜡切片。将切片漂浮于38摄氏度的水浴中，然后转移至玻璃载玻片上。用耐试剂笔标记载玻片。将载玻片置于托盘上，于55至60摄氏度的烘箱中熔蜡1小时。

然后，将载玻片从烘箱中取出，并立即用三次连续的二甲苯浸泡（每次五分钟）进行脱蜡。随后，按照文本方案中的说明，通过依次浸入浓度递减的乙醇溶液，最后至去离子水中，对载玻片上的组织切片进行逐级水化。

将切片用蛋白酶处理30分钟以进行蛋白水解抗原修复，然后用PBST冲洗切片10分钟，并用3%过氧化氢处理10分钟。随后，再次用PBST洗涤切片10分钟。

首先，从缓冲液中取出一张载玻片，注意每次只处理一张载玻片，其余载玻片保持浸没状态，并用纸巾轻轻吸去组织切片周围的过量缓冲液。将载玻片放入湿盒中，在室温下用正常山羊血清孵育15分钟。

接下来，将切片置于湿盒中，加入预先确定的最佳稀释度的抗狂犬病病毒一抗和阴性对照抗体，在室温下孵育60分钟，期间不进行洗涤。随后，用PBST洗涤切片10分钟，再在湿盒中加入生物素标记的二抗，于室温孵育15分钟。

用PBST再次清洗载玻片10分钟。将载玻片置于湿盒中，室温下与链霉亲和素-HRP复合物孵育15分钟，再用PBST清洗10分钟。随后，在湿盒中加入AEC，室温孵育10分钟。用去离子水清洗载玻片10分钟，并用吉氏苏木精以1:2的比例用去离子水稀释后复染2分钟。

随后，将载玻片浸入去离子水中，冲洗掉多余的苏木精。将载玻片在Scott氏自来水溶液中冲洗30秒，再用去离子水洗涤10分钟。每次取出一张载玻片，使用水溶性封片介质封片。然后，用光学显微镜观察载玻片。