$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
从一张含有福尔马林固定、脱蜡并复水的颞动脉活检切片的载玻片开始,切片中浸润有免疫细胞,包括淋巴细胞和巨噬细胞。
活化的巨噬细胞表达叶酸受体β(FR-β)——一种与疾病相关的标志物,可将巨噬细胞与其他免疫细胞区分开来。
将载玻片转移至预热的缓冲液中,以回收表面受体。
用过氧化氢处理切片, 阻断细胞内过氧化物酶活性。
加入针对 CD3、CD68 和 FR-β 的一抗混合物,这些抗体可结合表达相应蛋白的免疫细胞。
加入与一抗结合的生物素标记二抗,并进行洗涤。
使用与生物素结合的链霉亲和素偶联酶进行孵育。
使用显色底物进行处理,该底物与酶相互作用,产生局部的棕色沉淀。
引入一种复染剂——苏木精,使细胞核染成蓝色。
在显微镜下,将体积小、呈圆形、棕染的细胞鉴定为表达CD3的淋巴细胞,将体积大、形态不规则、棕染的细胞鉴定为表达CD68和FR-β的巨噬细胞。
对切片中的巨噬细胞进行定量,以确定其在总浸润免疫细胞中的比例。
进行抗原修复时,将染色架转移至一个玻璃容器中,加入200微升、95摄氏度、10毫摩尔/升的柠檬酸盐缓冲液,孵育30分钟。孵育结束后,让切片在室温下冷却20分钟,然后用流水冲洗5分钟。
为了消除内源性过氧化物酶活性,首先使用疏水性标记笔在每个组织样本周围画圈,然后将样本在200 µL的3%过氧化氢溶液中孵育10分钟,随后每次用200 µL的Tris缓冲盐水溶液(TBSS)洗涤,共洗涤三次。最后一次洗涤后,轻轻拍干每张载玻片以去除多余的缓冲液,并向每张载玻片加入200 µL目标一抗混合液及盖玻片,在室温下的湿盒中孵育1小时。
孵育结束后,弃去盖玻片,用新鲜的TBSS缓冲液对载玻片进行三次洗涤,每次两分钟。除去多余的缓冲液后,向每张载玻片上加入200 µL适当浓度的生物素化二抗溶液,并加盖盖玻片,在室温湿盒中孵育45分钟。孵育结束后弃去盖玻片,按前述方法用TBSS缓冲液洗涤载玻片,然后去除多余的缓冲液。
在室温下用 200 微升 DAB 底物缓冲液孵育切片 10 分钟。孵育结束后,用 TBSS 和流动的自来水冲洗载玻片 10 分钟,然后用苏木精复染 3 分钟。随后,向每张载玻片加入 70 微升适当的封片介质,并缓慢将盖玻片倾斜覆盖在封片介质上,以避免盖玻片完全盖下时产生气泡。
进行组织病理学分析时,将切片置于光学显微镜载物台上,观察第一张组织切片的血管结构。然后,量化每张切片中巨噬细胞相对于淋巴细胞的数量。