一种改进的交联免疫沉淀方法用于高效鉴定小鼠睾丸中与蛋白质结合的RNA

取新鲜摘取的小鼠睾丸置于预冷的缓冲液中。去除白膜，即纤维组织层。

将睾丸进行吹打，以释放含有生殖细胞和塞尔托利细胞的曲细精管。

加入缓冲液，并对管腔进行紫外线 照射，使RNA与其结合蛋白发生不可逆交联，以保留相互作用。

离心并弃去上清液。

在含有RNase和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中重悬小管。

超声处理组织，释放蛋白质-RNA复合物及其他细胞内组分。RNase和蛋白酶抑制剂可使内源性RNase和蛋白酶失活。

加入DNase以降解DNA。加入稀释的RNase进行部分RNA消化。

离心并转移含有RNA-蛋白质复合物的上清液至含有高特异性靶向RNA结合蛋白的抗体包被磁珠溶液中。

施加磁场以分离珠子结合的蛋白质-RNA复合物。弃去上清液。

用缓冲液洗涤。通过磁力分离获得蛋白质-RNA复合物，并用于进一步的RNA-蛋白质相互作用分析。

开始此实验步骤时，为每项免疫沉淀实验采集适量年龄小鼠的睾丸组织约100毫克。将组织置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用精细尖头镊子，轻轻去除白膜。向组织研磨器中加入3毫升冰上预冷的PBS，使用松配合的玻璃研杵通过温和的机械力研磨组织。接着，将组织悬液转移至细胞培养皿中，并加入冰上预冷的PBS至总体积6毫升。快速振荡培养皿，使液体均匀覆盖皿底。

在冰上用254纳米波长、400毫焦耳/平方厘米的紫外线照射悬浮液三次进行交联。每次照射之间务必混匀悬浮液，然后将悬浮液收集至15毫升锥形管中，在4摄氏度条件下以1,200 × g 离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后，将悬浮液转移至1.5毫升离心管中，在4摄氏度条件下以1,000 × g 离心2分钟，弃去上清液。

首先，每个样品向新的离心管中加入 125 µL 蛋白 A 磁珠。将离心管置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。10 秒后，吸去上清液，并用 1 mL 冰冷裂解缓冲液洗涤磁珠两次。将磁珠重悬于含 10 µg eCLIP 抗体的 100 µL 冷裂解缓冲液中。室温下旋转孵育 45 分钟，然后用 1 mL 冰冷裂解缓冲液再次洗涤磁珠两次。

首先，将组织沉淀重悬于 1 毫升含有 22 微升 50X EDTA-free 蛋白酶抑制剂混合液和 11 微升 RNA酶抑制剂的预冷裂解缓冲液中。将样品置于冰上裂解 15 分钟。超声处理各样品的步骤详见文本方案。接着，向每管中加入 4 微升 DNA酶，充分混匀。在 37 摄氏度、1,200 RPM 振荡条件下孵育 10 分钟。随后，加入 10 微升稀释的 RNA酶，充分混匀。在 37 摄氏度、1,200 RPM 振荡条件下孵育 5 分钟。

然后，在15,000 × g条件下离心 g 在4摄氏度下孵育20分钟以澄清裂解液。小心收集上清液。首先，将1毫升裂解液加入已准备好的磁珠中，在4摄氏度下旋转孵育样品2小时或过夜。随后，使用磁力架收集磁珠，并弃去上清液。用900微升高盐缓冲液洗涤磁珠两次，再用900微升洗涤缓冲液洗涤磁珠两次。