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免疫学
0 次观看 • 6:20 分钟 • July 8th, 2025
取自经抗原免疫的小鼠的继发性淋巴器官细胞，其中含有处于不同细胞周期阶段的抗原特异性 CD8+ T 细胞。
G1、S、G2 和 M 期是活跃分裂细胞的阶段，而处于 G0 期的细胞则处于静止状态。
加入荧光活力染料以标记死细胞，并加入与T细胞表面标志物CD3和CD8结合的荧光标记抗体。
引入荧光素标记的抗原肽-MHC多聚体，以结合T细胞受体，从而标记抗原特异性的T细胞。
使用缓冲液固定并通透细胞。
引入荧光标记的抗体以结合与细胞增殖相关的核蛋白——对处于活跃分裂状态的细胞进行染色。
加入荧光染料以标记 DNA。
使用流式细胞术筛选活细胞并鉴定抗原特异性的CD8+ T细胞 通过 表面结合的标记物
DNA染色强度可区分DNA含量较低的G0和G1期细胞与DNA含量较高的S期、G2期和M期细胞。缺乏细胞核蛋白特异性抗体可将G0期细胞区分开来。
通过将10×破膜洗涤缓冲液用蒸馏水稀释，配制新鲜的1×破膜洗涤缓冲液，并使用0.45微米滤器过滤以去除聚集体。根据滴定实验结果，用1×破膜洗涤缓冲液稀释单克隆抗体Ki67-FITC，每份样品最终体积为100微升。
向每管细胞中加入 3 毫升 1X 透化洗涤缓冲液，在室温下以 400 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液。再次加入 1X 透化洗涤缓冲液，离心以沉淀细胞，然后弃去上清液。
向沉淀中加入100微升稀释的单克隆抗体Ki67-FITC，涡旋混匀后避光孵育30分钟。孵育结束后，用4毫升1×透化缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤后离心并弃去上清液。
对于直接在流式细胞仪上检测的样品，向细胞沉淀中加入 350 微升 PBS；对于需要与 Hoechst 孵育进行 DNA 染色的样品，向细胞沉淀中加入 250 微升 PBS。配制 Hoechst 与 PBS 溶液，并将其加入各样品中，使终浓度为 2 微克/毫升。涡旋混匀后，将样品在避光条件下孵育 15 分钟。然后，将样品离心 5 分钟，并向细胞沉淀中加入 350 微升 PBS。
打开软件，通过点击工作区功能区中的创建组，建立与待分析的不同器官相对应的各个组。通过双击组名称打开修改组窗口，并在同步功能前插入勾选标记，以同步新创建的组。
将每个FCS文件拖动到其对应的组中，然后从完全染色的LN组开始创建设门策略。通过双击完全染色的样本来打开图形窗口，以在点图中显示该样本未设门的采集事件。请注意，x轴和y轴的标签与本手稿流式细胞仪设置文件中表2所指示的FCS文件中的标签一致。检查是否显示了足够数量的事件以实现适当的可视化。
如有需要，可通过点击工作区功能区中的心形图标打开首选项，选择图形，然后将图形类型设为点图，并核对相应框中绘制的点数是否正确，必要时进行修改。在图形窗口中以点图形式显示未设门控的事件，横轴为 DNA-A，纵轴为 DNA-W。两个轴均使用线性刻度。如有需要，可通过点击图形窗口中靠近各坐标轴标有“T”的框，将刻度从对数转换为线性。
在设门工具部分点击矩形，选择单个细胞群，然后在矩形门的中心双击，以在点图中显示单个细胞，其中横轴为FSC-A参数，纵轴为死细胞染料。
单击多边形以选择活细胞群体，这些细胞对死细胞染料呈阴性。在多边形门的中心双击，可在点图中显示细胞，其中横轴为FSC-A参数，纵轴为SSC-A参数。
单击 矩形，创建一个“宽松”门控，以包含该图中所有单个活细胞。双击宽松门控的中心，将在点图中显示细胞，其中 CD3 位于 x 轴，CD8 位于 y 轴。
使用适当的坐标轴刻度在图形窗口中进行可视化。如有必要，通过点击靠近各坐标轴并以 T 标示的框来修改 x 轴和 y 轴的刻度。选择 自定义 轴 功能 并修改 额外 阴性 数十年 宽度 基础 和 阳性 数十年 必要时。
通过点击多边形选择 CD3 阳性、CD8 阳性细胞。在 CD3 阳性、CD8 阳性门控的中心双击，以在点图中显示细胞，其中 x 轴为 Tetr-gag，y 轴为 Pent-gag。通过点击多边形选择抗原特异性 CD8 T 细胞。在 gag 特异性门控的中心双击，以在点图中显示细胞，其中 x 轴为 DNA-A，y 轴为 Ki67。在图形窗口的设门工具部分点击四分法，选择处于不同细胞周期时相的细胞。