一种用于抗原特异性CD8⁺ T细胞细胞周期分析的检测方法

取自经抗原免疫的小鼠的继发性淋巴器官细胞，其中含有处于不同细胞周期阶段的抗原特异性 CD8⁺ T 细胞。

G₁、S、G₂ 和 M 期是活跃分裂细胞的阶段，而处于 G₀ 期的细胞则处于静止状态。

加入荧光活力染料以标记死细胞，并加入与T细胞表面标志物CD3和CD8结合的荧光标记抗体。

引入荧光素标记的抗原肽-MHC多聚体，以结合T细胞受体，从而标记抗原特异性的T细胞。

使用缓冲液固定并通透细胞。

引入荧光标记的抗体以结合与细胞增殖相关的核蛋白——对处于活跃分裂状态的细胞进行染色。

加入荧光染料以标记 DNA。

使用流式细胞术筛选活细胞并鉴定抗原特异性的CD8⁺ T细胞 通过 表面结合的标记物

DNA染色强度可区分DNA含量较低的G₀和G₁期细胞与DNA含量较高的S期、G₂期和M期细胞。缺乏细胞核蛋白特异性抗体可将G₀期细胞区分开来。

通过将10×破膜洗涤缓冲液用蒸馏水稀释，配制新鲜的1×破膜洗涤缓冲液，并使用0.45微米滤器过滤以去除聚集体。根据滴定实验结果，用1×破膜洗涤缓冲液稀释单克隆抗体Ki67-FITC，每份样品最终体积为100微升。

向每管细胞中加入 3 毫升 1X 透化洗涤缓冲液，在室温下以 400 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液。再次加入 1X 透化洗涤缓冲液，离心以沉淀细胞，然后弃去上清液。

向沉淀中加入100微升稀释的单克隆抗体Ki67-FITC，涡旋混匀后避光孵育30分钟。孵育结束后，用4毫升1×透化缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤后离心并弃去上清液。

对于直接在流式细胞仪上检测的样品，向细胞沉淀中加入 350 微升 PBS；对于需要与 Hoechst 孵育进行 DNA 染色的样品，向细胞沉淀中加入 250 微升 PBS。配制 Hoechst 与 PBS 溶液，并将其加入各样品中，使终浓度为 2 微克/毫升。涡旋混匀后，将样品在避光条件下孵育 15 分钟。然后，将样品离心 5 分钟，并向细胞沉淀中加入 350 微升 PBS。

打开软件，通过点击工作区功能区中的创建组，建立与待分析的不同器官相对应的各个组。通过双击组名称打开修改组窗口，并在同步功能前插入勾选标记，以同步新创建的组。

将每个FCS文件拖动到其对应的组中，然后从完全染色的LN组开始创建设门策略。通过双击完全染色的样本来打开图形窗口，以在点图中显示该样本未设门的采集事件。请注意，x轴和y轴的标签与本手稿流式细胞仪设置文件中表2所指示的FCS文件中的标签一致。检查是否显示了足够数量的事件以实现适当的可视化。

如有需要，可通过点击工作区功能区中的心形图标打开首选项，选择图形，然后将图形类型设为点图，并核对相应框中绘制的点数是否正确，必要时进行修改。在图形窗口中以点图形式显示未设门控的事件，横轴为 DNA-A，纵轴为 DNA-W。两个轴均使用线性刻度。如有需要，可通过点击图形窗口中靠近各坐