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从一个含有小鼠视网膜髓系细胞单细胞悬液的多孔板开始,这些细胞包括小胶质细胞、单核细胞和中性粒细胞。
小胶质细胞——或视网膜吞噬性免疫细胞,因吞噬了预先经玻璃体内注射的、由真菌来源的荧光标记生物颗粒而表现出荧光。
离心并加入Fc受体抗体,以阻断非特异性结合位点。
加入针对CD11b、Ly6C和Ly6G表面蛋白的荧光标记抗体混合物,这些抗体可与表达这些蛋白的髓系细胞结合。
去除未结合的抗体。使用碘化丙啶处理,该试剂可穿透受损的细胞膜,从而特异性地染色死细胞。
在流式细胞术中,激发碘化丙啶以排除死细胞,并鉴定无荧光的活细胞。
使用紫色激光照射细胞;发出荧光的活细胞代表表达 CD11b 的髓系细胞。
接着,用红色激光照射,激发 CD11b 阳性细胞内的近远红荧光染料,以标记表达 Ly6C 的单核细胞和表达 Ly6G 的中性粒细胞。
使用蓝色激光激发细胞;残留的 CD11b 阳性细胞发出绿色荧光,表明小胶质细胞摄取了荧光颗粒。
玻璃体内注射3小时后,使用45度角镊子轻轻按压眼睑以使眼球突出。将镊子置于眼球后方并轻轻牵拉。随后,在解剖显微镜下将眼球转移至含有少量含钙镁PBS的培养皿的干燥区域,并用超细镊子的一端在角膜缘处穿刺眼球。接着,用精细的45度角镊子夹住眼球,使用弹簧剪沿角膜缘剪开,直至大约剪开一半周长。
将眼球转移至 PBS 中,使用另一把精细的 45 度角镊子撕开角膜和巩膜。晶状体和视网膜将完整地取出。确保晶状体与视网膜分离,然后将视网膜转移至含有 2 毫升含钙和镁的 PBS 的 5.4 毫升聚苯乙烯试管中。
为了获得视网膜细胞的单细胞悬液,根据制造商的说明使用神经组织解离试剂盒,并将细胞重悬于200 µL染色缓冲液中。然后,将样品转移至96孔U型底板的一个孔中。离心后,倒置平板以弃去上清液,并在每孔中加入含CD16/CD32抗体的25 µL染色缓冲液,在室温下封闭Fc受体5分钟。接下来,在避光条件下,于室温下用感兴趣的抗体对细胞染色15分钟。
然后,离心收集细胞,并用每孔200微升新鲜染色缓冲液洗涤一次。接着,将细胞沉淀重悬于200微升染色缓冲液和活性染料中,转移至1.2毫升微量滴定板管中。随后,用额外的100微升染色缓冲液和活性染料洗涤各孔,并将洗涤液与相应的样品合并,用于流式细胞术分析。