利用基于DNA的张力探针评估免疫细胞施加的受体作用力

从带有聚乙二醇锚定金纳米颗粒的功能化玻璃盖玻片开始。

加入含有DNA发夹结构的张力探针，该探针由两个寡核苷酸分别杂交于发夹结构的相反两端构成。

配体链包含荧光基团和生物素，而锚定链含有淬灭剂和巯基。在此体系中，淬灭剂抑制荧光信号。

DNA探针与金纳米颗粒结合，并锚定在玻璃盖玻片上。

加入链霉亲和素，使其与配体链上的生物素分子相互作用。

加入可与预先结合的链霉亲和素分子结合的生物素化配体。

将CD8阳性T细胞覆盖在盖玻片上；其受体与固定的配体相互作用，形成受体-配体相互作用位点。

这种相互作用产生一种力，使DNA发夹结构解折叠，将荧光团与淬灭剂分离，从而促进荧光发射。

引入非荧光锁定链，与探针的未折叠区段结合，以保护荧光信号。

通过定量荧光来评估免疫细胞施加的受体受力情况。

首先，将25毫米的盖玻片放置在50毫升烧杯中的聚四氟乙烯架上，并通过将盖玻片浸入水中清洗三次。混合等体积的乙醇和水，取40毫升该溶液加入含有支架和盖玻片的烧杯中。然后，使用封口膜密封烧杯。

将烧杯放入超声波清洗器中，超声处理15分钟以清洗盖玻片，超声结束后弃去液体。随后，用水至少冲洗六次装有支架和盖玻片的烧杯，以去除残留的有机溶剂。配制新鲜的piranha溶液时，向一个50毫升的烧杯中加入30毫升浓硫酸，然后缓慢加入10毫升过氧化氢。使用玻璃移液管末端轻轻混合piranha溶液。

开始蚀刻时，将承载盖玻片的支架转移至盛有piranha溶液的烧杯中，在室温下孵育30分钟，以清洁并使盖玻片表面羟基化。随后，使用钢制或聚四氟乙烯镊子将支架转移至一个洁净的50毫升烧杯中，用水冲洗六次。为彻底去除水分，将承载盖玻片的支架浸入装有40毫升乙醇的50毫升烧杯中，然后弃去乙醇。

接着，将支架浸入含有3%氨基丙基三乙氧基硅烷的40毫升乙醇溶液中，在室温下反应1小时，以启动与盖玻片表面羟基的反应。用40毫升乙醇将盖玻片表面浸没清洗六次，然后在80摄氏度的烘箱中干燥20分钟。

用 Parafilm 膜覆盖培养皿内底部，以防止盖玻片在培养皿内滑动。然后将带有氨基的盖玻片放置好，使需用 DNA 张力探针功能化的面朝上。将盖玻片置于 -20 摄氏度保存，以备后续使用。

为了修饰盖玻片上的氨基，加入硫辛酸-PEG-NHS和mPEG-NHS，并将培养皿在室温下孵育1小时。孵育结束后，用纯水冲洗表面三次。随后，在一组三明治式盖玻片中加入100微升含有1毫克/毫升磺基-NHS-乙酸酯的0.1摩尔碳酸氢钠溶液，孵育30分钟以完成钝化处理。

向每个盖玻片加入0.5毫升金纳米颗粒，在室温下孵育30分钟。孵育结束后，用清水冲洗盖玻片三次。将黑空穴淬灭剂2链以10:1的比例加入退火后的DNA张力探针中，随后每两个盖玻片加入100微升该混合物，制成三明治结构。

将一个湿润的实验室用纸球小心地放入培养皿中，远离盖玻片，并用封口膜密封培养皿，防止溶液干燥。随后，用铝箔包裹培养皿，在4摄氏度下避光孵育过夜。次日，组装成像腔室，注意在拧紧腔室时避免表面产生裂纹。然后，向成像腔室中加入0.5至1毫升的Hank's平衡盐溶液。

使用 Cy3B 通道和 100 倍物镜捕获细胞铺在 DNA 发夹张力探针上并开始铺展时的荧光信号。配制 100 微摩尔非荧光锁定链储备液后，在所需时间点，将其加入成像腔室中的细胞，终浓度为 1 微摩尔，通过移液与细胞混合，以保存张力信号。

锁定约10分钟后，使用落射荧光显微镜采集延时录像或终点图像，用于定性的张力图谱绘制和定量分析。