一种基于CFSE的检测方法用于监测感染小鼠皮肤树突状细胞向引流淋巴结的迁移

取一只麻醉的小鼠，将Mycobacterium bovis BCG悬液注射至后肢足垫。

皮肤树突状细胞识别并吞噬分枝杆菌。

此外，经过加工的分枝杆菌组分会在MHC II类分子上呈递。

将可穿透细胞的CFSE染料注射到同一足垫中。

细胞内酯酶将CFSE切割为不可透过细胞膜的荧光产物，从而对细胞进行染色。

此外，活化的树突状细胞会迁移 通过 淋巴管至腘窝淋巴结，激活T细胞。

手术切除腘窝淋巴结，并通过滤网进行匀浆，获得单细胞悬液。

离心并用缓冲液重悬细胞。

将细胞转移至流式细胞术管中。离心并用抗体混合物处理细胞。

Fc阻断抗体可阻断Fc受体，而荧光标记抗体则结合免疫细胞表面的CD11c和MHC II类分子。

通过流式细胞术，鉴定出高表达MHC-II且低表达CD11c的CFSE标记的皮肤树突状细胞，以确认其已迁移至淋巴结。

对于Mycobacterium bovis BCG注射，在通过夹趾法确认小鼠已达到适当的镇静水平后，使用装有29号半英寸针头的注射器，向8至12周龄小鼠的后足垫接种1 × 10⁶个菌落形成单位的细菌及30 µL PBS。对照组足垫仅注射PBS。随后观察动物，直至其完全恢复卧姿并能够将体重施加于注射过的足垫上。

进行CFSE注射时，在BCG注射后的适当时间点，将一管室温下5毫摩尔的CFSE用PBS稀释十倍，注意充分重悬溶液。然后用稀释后的CFSE填充注射器，向之前接受第一次注射的同一后足垫注入20微升。CFSE注射24小时后，仔细在后侧大腿处做一垂直切口，并清除肌肉周围的脂肪组织。

接下来，使用剪刀和镊子暴露并切除位于膝窝脂肪囊深处的腘窝淋巴结。将淋巴结转移至含有0.5毫升冰上预冷的无菌PBS的容器中，并将淋巴结置于六孔板的一个孔内（孔中含5毫升PBS），用3毫升注射器的推杆通过70微米细胞筛网进行研磨均质。用另外5毫升缓冲液冲洗筛网，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。随后离心细胞，将沉淀物重悬于适量缓冲液中。

为了进行流式细胞术标记，将 1 至 10 × 10⁶ 个细胞分装至 5 毫升圆底聚苯乙烯管中，并用新鲜的 FACS 缓冲液洗涤细胞。将细胞沉淀重悬于 50 至 100 微升含抗小鼠 CD16/CD32 抗体（用于阻断非特异性 Fc 介导的相互作用）的适当抗体混合液中，加入 FACS 缓冲液并在冰上孵育，避光。30 至 45 分钟后，用 FACS 缓冲液洗涤细胞，再将细胞沉淀重悬于 50 至 100 微升新鲜 FACS 缓冲液中。