一种定量检测感染性原代巨噬细胞中胞质与液泡内Salmonella的实验方法

取一培养骨髓来源的巨噬细胞，移除培养基后，加入表达荧光胞质蛋白的沙门氏菌（Salmonella）细菌。

离心以促进细菌与巨噬细胞接触，并进行孵育。

细菌与巨噬细胞受体结合，促进其在吞噬体内的内化。

吞噬体与内体来源的囊泡融合，同时细菌分泌效应蛋白，将吞噬体重塑为 沙门氏菌含液泡或SCV

部分 SCVs 破裂，将内化细菌释放到细胞质中。

加入抗生素以清除未被内化的细菌。吸除含有死亡细菌的培养基。

加入含有去垢剂皂苷（digitonin）的缓冲液，该去垢剂可与胆固醇结合。

Digitonin 与富含胆固醇的质膜结合后形成孔隙，而缺乏胆固醇的 SCV 膜则保持完整——这一现象称为差异性通透化。

加入荧光标记的抗体，使其进入已透化的细胞并与胞质内的细菌结合。

使用去污剂裂解细胞和SCVs，释放所有内化细菌。

通过流式细胞术，定量分析双重染色的胞质细菌和单重染色的囊泡内细菌。

在感染前一天，将细菌菌株接种于3毫升添加了链霉素和氨苄青霉素的LB（Luria-Bertani）培养基中，于37摄氏度摇床过夜培养。为考虑个体差异，将盖玻片放入24孔板的孔中，用于设置对照组。

为进行感染实验的细胞铺板，将野生型骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）以每孔0.125×10⁶个细胞的密度接种于1毫升原代巨噬细胞培养基中。随后，将细胞置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜。

第二天，通过测量稀释后培养物在600纳米波长处相对于磷酸盐缓冲液的光密度（OD₆₀₀）来确定过夜培养物中Salmonella的浓度。这可确保OD₆₀₀的测量值处于分光光度计的线性范围内。

计算每毫升中 Salmonella 的浓度。OD₆₀₀ 为1对应10亿个细菌。用巨噬细胞培养基稀释细菌，使 Salmonella 浓度达到每毫升125万个细胞。

为用Salmonella感染细胞，从BMDM中移除培养基。向未感染的对照孔B1至B3以及C1至C3中加入1毫升巨噬细胞培养基，然后向孔A1至A5中加入1毫升Salmonella菌液，使感染复数达到每个细胞10个细菌。

将培养板在37摄氏度、300 × g 条件下离心15分钟，以同步感染过程，随后将培养板转移至37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育。感染后1小时，从孵箱中取出培养板，加入0.1毫升含庆大霉素的巨噬细胞培养基，以杀灭胞外细菌。

将庆大霉素加入所有孔中，包括未感染的对照孔，以确保所有细胞接受相同的处理。然后，将培养板转移至37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。感染后两小时，从培养箱中取出培养板，用1毫升预热的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）清洗所有孔两次。

将 DMEM 替换为预热的含庆大霉素的巨噬细胞培养基，以防止任何残留的胞外细菌生长，然后将培养板放回培养箱中。在到达预定分析时间点之前，按照文本方案所述，配制新鲜的 KHM 缓冲液、含洋地黄皂苷的 KHM 缓冲液和