一种通过浊度分析法监测经预处理人血小板胶原诱导聚集的方法

从含有经预处理的人体血小板悬液的玻璃比色皿开始，其中包含未活化的血小板和纤维蛋白原——一种血浆糖蛋白。

比色皿包含一个用于均匀混合的搅拌装置。

将对照比色皿放入聚集仪中，通过测定浊度来评估聚集情况。

介绍胶原蛋白——一种血小板聚集的激动剂，可与血小板表面受体相互作用，并激活下游信号转导级联反应。

这会导致ATP释放 通过 Pannexin 1 通道——一种血小板表面通道，可启动血小板活化和形态改变，导致聚集曲线下降。

纤维蛋白原进一步交联活化的血小板，促进胶原诱导的血小板聚集，改变浊度，并导致聚集曲线逐渐上升。

用高浓度的Pannexin 1通道抑制剂处理检测比色皿，以阻断该通道。

将胶原加入比色皿中。抑制剂的相互作用会阻止ATP释放，从而抑制胶原诱导的血小板聚集，表现为浊度无变化且聚集曲线呈平坦状。

为制备富血小板血浆，将采集的血液以5毫升等分试样转移至15毫升离心管中，在250 × g 条件下于37 °C离心13分钟。离心后，小心吸除样品的上层液体，避免吸入红细胞和白细胞污染。随后，将获得的富血小板血浆转移至新的15毫升离心管中，在37 °C孵育10分钟。再将富血小板血浆在2,200 × g 条件下离心12分钟。

接下来，弃去上清液，使用塑料巴斯德吸管，将沉淀物在含有肝素（2 微升/毫升）和前列环素（25 微摩尔，2.5 微升/毫升）的 Tris-HCl 缓冲液配制的 10 毫升 TA 缓冲液中轻轻重悬。将样品在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。然后，每毫升加入 2.5 微升的 25 微摩尔前列环素，并在 1,900 × g 条件下离心 8 分钟。

离心后，弃去上清液，用塑料巴斯德吸管将沉淀物重悬于 5 毫升 TA 缓冲液中，该缓冲液含有每毫升 2.5 微升的 25 微摩尔前列环素。将血小板再次于 37 摄氏度孵育 10 分钟。在样品孵育的同时，取 150 微升血小板悬液转移至 1.5 毫升离心管中，使用自动细胞计数器对血小板进行计数。

孵育后，向血小板悬液中加入每毫升2.5微升的25微摩尔前列环素，立即以1,900 × g离心样品 g 8分钟。弃去上清液，用含有0.32单位/毫升apyrase的TA缓冲液重悬沉淀，调整体积使血小板密度达到每微升250,000个。在进行聚集测量前，将细胞悬液于37摄氏度孵育至少30分钟。

进行比浊法检测时，将纤维蛋白原溶解于Tyrode缓冲液中，配制成56毫克/毫升的溶液。取260微升血小板悬液，用移液器加入含有10微升纤维蛋白原溶液和磁力搅拌棒的玻璃比色杯中。然后，将悬液置于聚集仪的孵育孔中，在37摄氏度下孵育2至3分钟。

接下来，加入10 µL用蒸馏水配制的2.8 mmol/L光辉蓝FCF储备液，并将悬浮液在37°C预孵育7分钟。为校准聚集仪，准备一支比色皿，其中含有10 µL纤维蛋白原、10 µL光辉蓝FCF溶液以