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免疫学
0 次观看 • 5:52 分钟 • July 8th, 2025
取一个涂有明胶的多孔板，其中培养有表达CXCR4的人脑癌细胞。
更换为钙离子敏感性染料。细胞内酯酶将染料裂解为不可透过细胞膜的产物，该产物可结合钙离子，并表现出增强的荧光信号。
去除染料，洗涤，并加入缓冲液。
将培养板放入荧光酶标仪中，并设置含有CXCR4相互作用化合物和趋化因子CXCL12的培养板。
使用预设的自动参数，将逐渐增加的化合物浓度注入检测孔中，随后加入特定浓度的 CXCL12。
在不含化合物的对照孔中，CXCL12 与 CXCR4 结合。
这种结合会激活信号级联反应，将钙离子释放到细胞质中，钙离子与染料结合后增强荧光强度。
然而，在检测孔中，相互作用的化合物会抑制 CXCL12 与 CXCR4 的结合，影响钙离子动员，并引起剂量依赖性的荧光降低，从而证实这些化合物为 CXCR4 拮抗剂。
在细胞传代当天，用100微升0.1%明胶溶液包被黑色壁、透明底的聚苯乙烯96孔板的每个孔，并在室温下孵育2小时。在明胶凝固的同时，使用胰蛋白酶-EDTA溶液将目标细胞从培养瓶底部消化下来，待细胞脱落后，将其重悬于50毫升锥形管中的新鲜培养基中。
计数后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于新鲜培养基中，调整浓度至每毫升含1 × 105个活细胞。当培养板准备就绪后，弃去多余的明胶溶液，并用实验室纸巾将培养板干燥。随后，每孔加入200微升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，弃去洗涤液后，每孔加入200微升细胞悬液，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜培养。
第二天早晨，轻敲培养板以弃去各孔中的培养基，并将培养板倒置在纸巾上晾干。随后，每孔加入 100 µL 负载染料溶液对细胞进行标记，在室温避光条件下孵育 45 分钟。在细胞孵育的同时，向趋化因子板的每孔中加入 75 µL CXCL12，向化合物板的每孔中加入 50 µL 待测化合物。
接下来，先开启荧光酶标仪的制冷单元，然后开启酶标仪本身。待系统启动几分钟后，打开酶标仪软件。为设置检测程序，在设置选项卡下，选择读数模式，并选择与负载染料相对应的合适激发波长和发射波长。
选择“混合并转移液体”选项卡，以自动混合化合物板中的化合物。在“转移液体”选项卡中，设置从化合物板的每个孔转移20 µL至测量板，并将移液吸头位置置于液面以下20 µL处。设定吸液速度为50 µL/s， dispense速度为25 µL/s，然后点击“读取并转移液体”。
在第一个时间段内，选择60次读数，读数间隔时间为1秒，其中在化合物加入检测板之前记录10次读数，之后完成50次读数。设置第二个时间段，读数间隔时间为30秒，共18次读数。为该实验方案选择三次吸头清洗，每次清洗步骤均设置为包含适当的清洗液、一个清洗循环、快速泵速以及每次清洗5次往复运动。
使用“暂停移液器”功能，设置移液器暂停时间为300秒，并使用“转移液体时混合”设置，使CXCL12溶液在趋化因子板内自动混合。在随后的“转移液体”选项卡中，设置从趋化因子板的每个孔中转移25 µL至检测板，并将吸头置于液面以下20 µL的位置。设定吸液速度为50 µL/s，分配速度为25 µL/s。
使用 “读取并转移液体” 按钮，将第一个区间设置为包含 145 次读数，读数间隔时间为 1 秒。将第二个区间设置为读数间隔时间 6 秒，共 20 次读数。选择额外的三次洗针循环，然后点击 “设置孵育温度”，并将设备温度设为 37 摄氏度。
在上样染料孵育结束后，弃去检测板中的缓冲液，并将检测板在实验用纸巾上干燥。用每孔150微升的检测缓冲液洗涤细胞，两分钟后更换为每孔80微升的检测缓冲液。将检测板置于读板位置，化合物板置于源2位置，趋化因子板置于源3位置，黑色吸头盒置于源1位置。
关闭设备，然后点击“程序信号测试”，以测定整个孔板的背景相对光单位值及荧光变异情况。在弹出窗口中选择测试“信号”。如果获得的背景值在8,000至10,000相对光单位之间，则选择“更新”，然后点击“保存”，以保存主程序。