用于筛选抗病毒化合物的病毒附着测定

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从含有预冷人肝癌细胞单层的多孔板开始。

用携带荧光素酶基因的转基因丙型肝炎病毒和靶化合物的混合物处理测试孔;单独用病毒处理对照孔。

测试孔中,靶分子与病毒糖蛋白和细胞表面受体相互作用,防止病毒附着。

然而,在对照孔中,病毒糖蛋白与细胞表面受体相互作用,使其能够附着。低温会抑制病毒进入。

除去上清液,引入培养基,并在最佳温度下重新孵育,以促进病毒进入。

进入

后,病毒释放遗传物质,启动病毒蛋白和荧光素酶的合成,这些蛋白和荧光素酶被分泌到培养基中。

转移含荧光素酶的上清液,并引入底物。

酶-底物相互作用产生与荧光素酶水平成比例的光。

与对照孔相比,测试孔中的光强度较低,表明目标化合物的抗病毒特性。

对于病毒附着测定,在 96 孔板中每孔接种 1 x 104 个细胞,并孵育过夜以进行细胞附着。第二天早上,首先,将含有细胞单层的96孔板在4摄氏度下冷却1小时。

冰上制备测试化合物和病毒混合物。例如,HCV-CHLA、HCV - 1% DMSO 或阳性对照 HCV-肝素溶液,每个处理孔含有 102 FFU 病毒。轻轻地从细胞培养孔中吸出培养基。然后,立即在一式三份的孔中加入100微升病毒测试化合物混合物,注意不要升高温度。将板在保持在 4 摄氏度的冰箱中孵育三个小时。

病毒颗粒会在 4 摄氏度时附着在细胞表面,但不会被内化。接下来,吸出上清液。用 200 微升冰冷的 PBS 轻轻洗涤细胞两次。向每个孔中加入 100 微升基础培养基,然后在 37 摄氏度下孵育 72 小时。最后,为了定量从感染细胞中释放的荧光素酶报告基因,从每个样品孔中收集上清液并进行高斯荧光素酶测定。

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Last updated: 4 July 2026