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从一种可切割RNA的脱氧核酶开始,这是一种催化性DNA,当其结合到特定的细菌生物标志物时会被激活。
DNAzyme 与链霉亲和素包被的磁珠相连 通过 在5'端带有生物素,在3'端连接尿素酶标记的寡核苷酸,形成一种功能化的磁珠。
向含有功能化磁珠的离心管中加入大肠杆菌(E. coli)裂解液。
来自裂解液的特定 E. coli 生物标志物激活DNAzyme,触发RNA连接的切割,导致DNAzyme-脲酶偶联物的解离。
使用磁力架固定磁珠,并移除与磁珠结合的DNAzyme-脲酶偶联物。
将含有脲酶的上清液转移至另一支试管中。
加入 pH 指示剂染料——酚红,以及尿素溶液。
脲酶将尿素水解为氨和二氧化碳。
氨是一种弱碱,可提高溶液的pH值,引起颜色变化,从而指示大肠杆菌(E. coli)生物标志物的存在。
按照文本方案制备 E. coli 细胞后,加入 100 微升 RB 缓冲液并涡旋振荡,以预清洗一个 1.5 毫升的微量离心管。然后,弃去缓冲液。
向洗涤后的离心管中加入15微升组装好的EC1,然后将离心管置于磁力架上,吸除上清液。从磁力架上取下离心管,加入100微升RB缓冲液,并小心地重悬磁珠。
使用 RB 再次洗涤磁珠两次并去除 RB 后,向管中加入 10 µL 的 E. coli 样品,通过轻弹管壁轻轻混匀内容物。然后在室温下孵育反应体系 1 小时。
孵育结束后,加入 90 微升双蒸水,将离心管置于磁力架上。磁分离约三分钟后,小心地将 85 微升上清液转移至 0.5 毫升微量离心管中。
吸取溶液时必须小心操作,避免吸入任何磁珠。这些磁珠含有脲酶,会引发假阳性信号。
加入 15 µL 的 0.04% 酚红和 100 µL 底物溶液。然后在特定时间间隔拍照,记录颜色变化。