一种用于研究痘病毒感染细胞中翻译调控的荧光素酶报告基因检测方法

取含有编码萤火虫荧光素酶（Fluc）或海肾荧光素酶（Rluc）的报告mRNA的转染复合物。

Fluc mRNA 含有 5' 多聚腺苷酸序列，即多聚(A)前导序列，而 Rluc mRNA 缺少该序列。

转染未感染和感染痘病毒的哺乳动物细胞以递送报告基因mRNA，并进行培养。

在未感染的细胞中，真核起始因子结合到 mRNA 的 5' 帽结构，随后招募小核糖体亚基和起始 tRNA。

小亚基定位到起始密码子后，大亚基结合并合成荧光素酶蛋白。

在感染细胞中，痘病毒介导的小亚基磷酸化可直接在前导序列上促进核糖体组装，从而增强荧光素酶（Fluc）的产生。

裂解细胞以释放荧光素酶。

加入Fluc底物，该底物被酶氧化并发出光。使用酶标仪测量发光信号。

重复上述步骤检测Rluc，以确定病毒侵染细胞中Fluc发光强度相对于Rluc的相对增加量。

在24孔板中接种HeLa细胞，使次日细胞融合度达到80%至90%，然后在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜。以感染复数为5的Vaccinia病毒感染HeLa细胞，并保留未感染的HeLa细胞作为对照，随后将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10至12小时。在感染后所需时间点，取480纳克携带12A序列的萤火虫荧光素酶mRNA和20纳克携带Kozak序列的Renilla荧光素酶mRNA，加入同一微量离心管中混合。

在另一个微量离心管中，加入 1.1 µL 阳离子脂质转染试剂。向两个管中各加入 55 µL 低血清培养基。混匀后室温孵育 5 分钟。然后，将含有低血清培养基的 55 µL 阳离子脂质转染试剂加入含 mRNA 的管中。用移液器轻轻但充分混匀，并在室温下孵育 15 分钟。孵育期间，从细胞中移除细胞培养基，并每孔加入 400 µL 低血清培养基。

孵育完成后，将100 µL混合物逐滴均匀加入24孔板的每孔中。在使用12A-Fluc和Kozak-Rluc mRNA共转染5小时后，移除细胞中的减血清培养基，并加入150 µL荧光素酶检测试剂盒中的1×裂解缓冲液（该试剂盒可进行双报告基因检测）以裂解细胞。室温孵育10分钟后，用无菌橡胶头和注射器刮取细胞，并转移至微量离心管中。

为沉淀细胞碎片，将裂解液在12,000 × g 条件下离心 g 在4摄氏度下孵育10分钟。将上清液每孔30微升转移至不透明白色96孔板（带实心底）中。使用多功能酶标仪上的荧光素酶检测试剂盒，按照文中所述，通过动力学模式检测双发光信号。