一种用于测定抗生素最低抑菌浓度的微量滴定板法

取含有系列稀释的氨基糖苷类抗生素的微量滴定板。其中一块板含有NTBC，一种合成药物。

接种Pseudomonas aeruginosa（一种革兰氏阴性菌），并进行培养。

在未使用 NTBC 处理的孔中，细菌会产生吡咯黑素——一种保护性的胞外色素，而该药物可抑制吡咯黑素的生成。

阳离子抗生素与细菌外膜上的阴离子脂多糖（LPS）结合，取代阳离子桥接结构，从而破坏膜的稳定性。

当抗生素进入细菌后，会结合到30S核糖体亚基的氨酰基位点（A位点）。

结合的抗生素可阻止氨酰-tRNA与核糖体结合以及核糖体沿mRNA移动，从而干扰蛋白质合成并抑制细菌生长。

孵育结束后，测定培养物的光密度以评估细菌生长情况。

能够抑制细菌生长的最低抗生素浓度称为最低抑菌浓度，即 MIC。

NTBC处理孔与未处理孔的MIC值相似，表明NTBC对细菌的抗生素敏感性无影响。

在进行 MIC 测定前一天，分别在含有和不含 2-[2-硝基-4-三氟甲基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮（NTBC）的 LB 培养基中制备待测菌株的培养物。本实验示例使用 300 微摩尔的 NTBC 作为代表性浓度。确定 NTBC 适当浓度的滴定方法详见实验方案文本。将培养物在 37 摄氏度有氧条件下过夜培养。次日，为 MIC 测定配制含 NTBC 的 LB 和含 DMSO 的 LB 主溶液。

测试一种抗生素对一株细菌时，将600 µM的NTBC加入2 mL LB培养基中，混匀制成NTBC母液。NTBC的添加浓度为600 µmol/L，是因为加入菌液后会进行两倍稀释，最终浓度为300 µmol/L。将等体积的溶剂DMSO加入2 mL LB培养基中，混匀制成不含NTBC的母液。这两种母液将用于制备抗生素储备液，以及在96孔板中建立稀释梯度。

接下来，在含NTBC的LB或含DMSO的LB主溶液中配制抗生素溶液。配制浓度为每毫升64微克的庆大霉素加或不加NTBC储备液。配制浓度为每毫升256微克的卡那霉素加或不加NTBC储备液。配制浓度为每毫升8微克的妥布霉素加或不加NTBC储备液。

配制好2倍浓度的抗生素溶液后，将每种抗生素溶液各100微升加入96孔板A行的四个孔中。例如，庆大霉素应加入A1至A4孔，卡那霉素应加入A5至A8孔，妥布霉素应加入A9至A12孔。

向96孔板的B至H行各加入50微升LB加NTBC或LB加DMSO的母液。确保一块板为LB加NTBC，另一块板为LB加DMSO。使用多通道移液器，通过将A行溶液50微升转移至B行，进行抗生素的两倍系列稀释。混匀溶液后更换吸头，再将B行溶液50微升转移至C行。以此类推，对剩余各行重复该步骤。

稀释G行后，从此行中移除50微升溶液并弃去。将H行用作无抗生素的细菌生长对照。取出过夜培养物。在用LB培养基洗涤所有培养物以去除培养基中残留的生物黑色素后，测定各培养物的OD₆₀₀ 值，并将过夜培养物用LB培养基进行稀释。

使用多通道微量移液器，向相应的孔中加入 50 微升稀释后的细菌培养液。每种菌株和抗生素浓度分别加入三个孔。向第四个孔中加入 50 微升 LB 培养基，作为细菌污染的对照。用封口膜覆盖 96 孔板，并在 37 摄氏度下孵育约 24 小时。

次日，目视观察各孔中细菌的生长情况。最小抑菌浓度（MIC）是指每种菌株的三个重复样本均未出现细菌生长的最低抗生素浓度。