0 次观看 • 4:10 分钟 • July 8th, 2025
取含有不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶且表面覆盖胶原蛋白的孔板，以模拟生理状态下的细胞外基质（ECM）。
添加可形成局灶性黏附（FAs）——介导细胞-ECM结合的复合物——的微血管内皮细胞，以感知水凝胶的刚度。
与较软的水凝胶相比，较硬的水凝胶可提高波形蛋白（vimentin）在细胞表面的表达水平，波形蛋白是一种细胞骨架组分。
加入经基因工程改造、在肌动蛋白组装诱导蛋白（ActA）启动子控制下表达荧光蛋白的单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）。
离心以同步细菌与宿主细胞的接触，并进行孵育。
细菌会结合波形蛋白。在刚性较高的水凝胶结合宿主细胞上，波形蛋白表达增多，导致细菌黏附和内吞作用增强。
加入抗生素，以消除未被内化的细菌。
内化的细菌会分泌毒素，破坏内体膜。逃逸至胞浆后可激活ActA启动子，表达荧光蛋白，从而标记细胞内细菌。
通过酶法解离细胞。利用流式细胞术检测，发现位于较硬水凝胶上的宿主细胞荧光信号更强，表明细菌内化程度更高。
根据文本方案制备单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）的过夜培养物后，取1毫升培养物转移至微量离心管中，在室温下以2,000 × g 离心4分钟。用细胞培养级的PBS将菌体沉淀洗涤两次后，加入1毫升PBS重悬菌体沉淀。
通过将10或50微升细菌悬液与1毫升MCDB-131完全培养基混合，制备感染混合物，使感染复数（MOI）达到每个宿主细胞约50个或10个细菌。从24孔板的各孔中移除培养基，注意不要破坏水凝胶或细胞。用1毫升MCDB-131完全培养基洗涤细胞一次，然后向每孔加入1毫升细菌悬液。
将盖子盖在培养板上，并用聚乙烯食品保鲜膜包裹以防止泄漏。在2,000 × g 条件下离心培养板10分钟，以同步化侵袭过程。随后，将培养物在37摄氏度条件下孵育30分钟。使用MCDB-131完全培养基洗涤样本4次，并将其放回组织培养孵箱。再孵育30分钟后，更换为含有20微克/毫升庆大霉素的MCDB-131完全培养基。
为了在感染后8小时进行流式细胞术，从24孔板的各孔中移除培养基，并使用组织培养用PBS洗涤孔内一次。移除PBS后，向每孔加入200微升胰蛋白酶-EDTA-胶原酶混合液。将培养板置于组织培养孵育箱中10分钟，以确保细胞完全脱落。
轻轻吹打每个孔八次后，加入 200 微升完全培养基以中和胰蛋白酶。将每个孔中的 400 微升细胞悬液转移至带有 35 微米细胞筛网帽的 5 毫升聚苯乙烯管中。通过流式细胞术分析样品。