定量延时显微镜技术用于评估细胞外基质刚度依赖性细菌扩散

取一块多孔板，其内含有贴壁的人内皮细胞单层，细胞培养于不同硬度的胶原包被聚丙烯酰胺水凝胶上。

与较软的水凝胶相比，较硬水凝胶上的细胞会发生显著的细胞骨架重排，增加细胞内张力。

用培养基洗涤细胞，并加入经基因改造的Listeria monocytogenes——该菌在肌动蛋白组装诱导蛋白（ActA）启动子调控下表达荧光蛋白。

离心以促进细胞与细菌的接触。孵育以介导细菌的内吞作用。

用培养基洗涤。加入庆大霉素处理，以清除未被内化的细菌。孵育。

内化细菌释放孔道形成毒素，破坏吞噬体膜。位于细胞质中的细菌上调 ActA 和荧光蛋白的表达，从而标记胞内细菌。

ActA蛋白诱导肌动蛋白聚合，形成肌动蛋白彗尾，推动细菌向前移动，导致邻近细胞的内吞作用，并促进细菌的播散。

孵育结束后，使用含染料的培养基对细胞核进行染色，随后更换为含庆大霉素的培养基。

进行延时显微成像。

较软的水凝胶相较于较硬的水凝胶能促进细菌的快速细胞间扩散，而较硬的水凝胶具有更高的细胞内张力，表明细菌的传播依赖于基质的刚度。

根据文本方案制备单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）的过夜培养物后，取1毫升培养物转移至微量离心管中，在室温下以2,000 × g 离心4分钟。用细胞培养级PBS洗涤菌体沉淀两次后，加入1毫升PBS重悬沉淀。

通过将10或50微升细菌悬液与1毫升MCDB-131完全培养基混合，制备感染混合物，使感染复数（MOI）约为每个宿主细胞50个细菌或每个宿主细胞10个细菌。从24孔板的孔中移除培养基，注意不要破坏水凝胶或细胞。

用1毫升MCDB-131完全培养基洗涤细胞一次，然后向每孔加入1毫升细菌。盖上培养板盖，并用聚乙烯食品保鲜膜包裹，以防泄漏。将培养板在2,000 × g 条件下离心10分钟，以同步化侵袭过程。随后，将培养物在37摄氏度下孵育30分钟。使用MCDB-131完全培养基洗涤样本4次，并将其放回组织培养孵箱中。再孵育30分钟后，更换为含有20微克/毫升庆大霉素的MCDB-131完全培养基。

按照文本方案将 HMEC-1 细胞接种于 PA 水凝胶上并用庆大霉素处理后，将培养板孵育 5 小时，以使 ActA 启动子激活并驱动 mTagRFP 开放阅读框的表达。

感染后4小时，将1微升1毫克/毫升的Hoechst染料与1毫升L15完全培养基混合，加入每孔中以染色细胞核。细胞孵育10分钟后，更换为含20微克/毫升庆大霉素的1毫升L15完全培养基。

使用自动对焦功能每 5 分钟对多个位置进行成像，以监测 LM 细菌在不同硬度水凝胶上接种的 HMEC-1 单层细胞中的扩散情况。