用于评估细胞外基质刚度依赖性细菌传播的定量延时显微镜

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取一个多孔板,在不同硬度的胶原蛋白包被的聚丙烯酰胺水凝胶上贴壁人内皮细胞单层。

较软的水凝胶相比,较硬的水凝胶上的细胞会经历显着的细胞骨架重组,从而增加细胞内张力。

用培养基洗涤细胞并加入工程化单核细胞增生李斯特菌 — 在肌动蛋白组装诱导蛋白 (ActA) 启动子下表达荧光蛋白。

心机以促进细胞与细菌的接触。孵育以介导细菌内吞作用。

用介质清洗。用庆大霉素处理以消除非内化细菌。孵化。

内化的细菌释放成孔毒素,破坏吞噬体膜。胞质细菌上调 ActA 和荧光蛋白表达,标记细胞内细菌。

ActA蛋白诱导肌动蛋白聚合,形成肌动蛋白彗尾,推动细菌前进,引起邻近细胞的内化,促进传播。

孵育后,使用含染料的培养基对细胞核进行染色。用含有庆大霉素的培养基代替培养基。

进行延时显微镜检查。

与细胞内张力增加的较硬水凝胶相比,较软的水凝胶可促进细菌细胞间的快速传播,这表明基质硬度依赖性细菌传播。

根据文本方案制备单核细胞增生李斯特菌的过夜培养物后,将1毫升培养物转移到微量离心管中,并在2,000倍g和室温下旋转4分钟。使用组织培养级PBS洗涤沉淀两次后,使用1毫升PBS重悬沉淀。

通过将 10 或 50 微升细菌悬浮液与 1 毫升 MCDB-131 全培养基混合来制备感染混合物,以获得每个宿主细胞约 50 个细菌或每个宿主细胞 10 个细菌的多重感染或 MOI。从 24 孔板的孔中取出培养基,注意不要破坏水凝胶或细胞。

使用 1 毫升 MCDB-131 全培养基洗涤细胞一次,然后向每个孔中加入 1 毫升细菌。盖上盖子放在盘子上,并用聚乙烯食品包装纸包裹它们,以免泄漏。将板以 2,000 x g 离心 10 分钟以同步侵袭。然后,将培养物在37摄氏度下孵育30分钟。使用 MCDB-131 全培养基,洗涤样品 4 次,然后将它们放回组织培养箱中。再过 30 分钟后,用补充每毫升庆大霉素 20 微克的 MCDB-131 全培养基替换培养基。

HMEC-1细胞接种在PA水凝胶上并根据文本方案用庆大霉素处理后,将板孵育五小时,以使ActA启动子打开并驱动mTagRFP开放阅读框的表达。

感染后四小时,将 1 微升 1mg/ml Hoechst 染料与 1 毫升 L15 全培养基混合,并将其添加到每个孔中以染色细胞核。将细胞孵育10分钟后,用1毫升L15全培养基替换培养基,每毫升庆大霉素补充20微克。

使用自动对焦功能每 5 分钟对多个位置进行成像,以监测 LM 细菌如何通过接种在不同刚度水凝胶上的 HMEC-1 单层传播。

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Last updated: 18 July 2026