0 次观看 • 2:48 分钟 • July 8th, 2025
从经抗病毒药物处理的感染性猪角膜中获取含有病毒的样本开始。
对样品进行连续稀释，以创建一系列浓度递减的病毒溶液。
最佳稀释度可防止多个病毒同时感染单个细胞。
将稀释后的样品加入宿主细胞单层，并进行孵育。
病毒附着于宿主细胞受体，进入细胞并启动复制。感染的细胞裂解，释放出病毒粒子。
加入甲基纤维素，这是一种黏性物质，可将病毒限制在邻近细胞中。
随后，病毒会导致感染区域的细胞死亡和空斑形成。
加入甲醇以固定细胞。
使用结晶紫对活细胞进行染色。
观察噬斑，表现为清晰的区域，指示被感染的细胞及细胞死亡，周围为结晶紫染色的未感染细胞。
最后，对最高稀释度下的噬斑数量进行计数，以定量起始溶液中的病毒滴度，从而确定抗病毒药物的效力。
为了定量从每只角膜收集的病毒量，用无血清培养基在微量离心管中制备病毒的log10倍系列稀释液，直至达到1 × 10-8的稀释度。
从每个细胞孔中吸除生长培养基后，将每种病毒稀释液（从1 × 10-3 开始）各取1毫升加入已接种细胞的孔中，并将感染后的细胞置于细胞培养箱中孵育2小时。孵育结束后，用PBS轻轻洗涤每个孔2次，然后每孔加入2毫升含甲基纤维素的培养基，继续孵育72小时，或直至观察到蚀斑形成。
观察到斑块后，向每个孔的角落缓慢加入1毫升甲醇，在室温下孵育15分钟。孵育结束后，缓慢吸出每个孔中的内容物，注意不要破坏细胞单层。
接着，向每个孔中加入1毫升结晶紫工作液，确保覆盖所有细胞，并在避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，弃去溶液，并将孔板置于吸水纸上干燥。然后，对稀释度最高的孔中的噬斑数量进行计数，重复3次，以定量起始溶液中的总病毒含量。