一种测定病毒感染细胞上多微生物生物膜启动的实验方法

取一个含哺乳动物细胞单层的多孔板。

在种子测试孔中接种单纯疱疹病毒。对照孔中不加病毒。

病毒附着于细胞表面的硫酸乙酰肝素并被内化 通过 内吞作用

病毒感染会触发乙酰肝素酶的分泌，后者可切割乙酰肝素硫酸盐并暴露特定的真菌受体。

将细胞与Staphylococcus aureus和Candida albicans菌丝管共同孵育。

在病毒感染的细胞中，硫酸乙酰肝素的耗竭会抑制细菌相互作用，同时促进真菌受体相互作用，从而阻止细菌与真菌的共定位。

在对照细胞中，细菌与硫酸乙酰肝素相互作用，而真菌则结合到可用的受体上。

这种微生物共定位会启动黏附——这是生物膜形成的第一步。

孵育结束后，去除未结合的微生物。加入裂解缓冲液，使细菌和真菌释放到培养基中。

将细胞裂解液涂布于含有生长培养基的平板上。孵育以进行菌落形成。

细菌菌落数量减少，同时真菌菌落数量相应增加，表明病毒抑制了细菌与真菌的共定位以及生物膜的启动。

为进行多微生物生物膜检测，将96孔板每孔加入200微升含每毫升2×10⁵个HeLa细胞的悬液。在37摄氏度下轻轻摇动培养30至45分钟，随后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育18小时。使用1× OptiMEM洗涤单层细胞。然后接种单一株HSV。每次仅测试一个菌株。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时。用100微升含镁和钙的37摄氏度磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤感染的单层细胞。然后用37摄氏度的Hanks平衡盐溶液（HBSS）替换PBS，每孔保留25微升HBSS。

接着，加入GT和/或S. aureus工作悬液，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。孵育结束后，每次吸取培养板的一列。立即用含镁和钙的300微升PBS重新填充各孔。

重复此洗涤步骤两次后，向每个孔中加入200微升以1:50稀释的滤膜除菌RIPA裂解缓冲液。

在处理其他菌株的细菌或真菌时，需确保所用 RIPA 的浓度足以实现细胞裂解，同时仍允许进行微生物活性检测。

快速吹打重悬HeLa细胞裂解液，取50微升滴加至甘露醇盐培养基和/或杀菌培养基上。然后用一支90度弯角的玻璃涂布棒将裂解液均匀涂布于平板表面。

将培养板孵育18小时后，人工计数每块培养板上的菌落数量。对照组包括S. aureus和/或C. albicans在未感染HSV的HeLa细胞上的黏附情况。