确定类中性粒细胞在淋巴瘤细胞对试验药物敏感性中的作用

取一个含有多孔板，其中包含淋巴瘤细胞（一种癌变的白细胞）的3D球状单培养物，以及淋巴瘤细胞与类中性粒细胞在基底膜基质中共同培养的共培养物。

加入一种可结合细胞内微管蛋白并破坏微管聚合的测试药物，从而导致细胞凋亡。

在共培养体系中，淋巴瘤细胞的直接接触可激活类中性粒细胞，诱导其分泌细胞因子。

这些细胞因子与淋巴瘤细胞受体相互作用，触发下游信号级联反应，并上调抗凋亡蛋白的表达，从而促进细胞存活。

弃去培养基。加入解离缓冲液以破坏细胞黏附。

刮取球状体并在振荡条件下孵育。将悬液转移至离心管中，继续振荡以形成单细胞悬液。

引入一种荧光标记的抗体混合物，用于标记淋巴瘤细胞和中性粒细胞样细胞。

加入荧光素标记的膜联蛋白V和碘化丙啶，以标记凋亡细胞和死亡细胞。

通过流式细胞术检测共培养中淋巴瘤细胞存活率的增加，表明中性粒细胞介导了对药物的保护作用。

建立三维共培养体系时，将50,000个RL淋巴瘤B细胞单独加入，或与HL60分化细胞混合，置于无菌的15毫升离心管中。

将样品离心，然后用剪去尖端至2至3毫米的1毫升移液器吸头，将沉淀重悬于300微升基底膜基质中。接着，在37摄氏度和5% CO2条件下，将每孔300微升细胞加入24孔板中孵育30分钟。

孵育结束时，向每个孔中加入 1 毫升完全 RPMI 培养基，将 3D 培养物放回培养箱继续培养 7 天，每两天更换一次培养基。在第 5 天，向培养物中加入 10 纳摩尔的长春新碱。

培养一周后，吸出培养基，每孔用 1 毫升冰浴 PBS 洗涤 2 次。然后，每孔加入含 EDTA 的 3 毫升冰浴 PBS，用 200 微升移液枪头刮取孔底以解离凝胶。将培养板在冰上轻轻振荡 30 分钟。随后，将细胞悬液转移至单独的无菌 15 毫升离心管中，在冰上继续轻轻振荡 30 分钟。

确认细胞悬液呈均一状态。随后离心收集细胞，用 PBS 洗涤一次，再将细胞沉淀重悬于含 FBS 的新鲜 PBS 中。最后，按照前述方法用相应的抗体和活率染料对细胞进行标记，并采用所示的设门策略，通过流式细胞术分析 RL 细胞和 HL60 分化细胞。