评估细胞毒性T淋巴细胞应答中免疫优势性的实验方法

以携带非反应性肽表位或具有不同免疫原性的肿瘤抗原衍生肽表位的荧光染料标记靶细胞开始。

这些细胞表现出不同的荧光强度——低、中等和高，分别对应于非反应性、亚显性以及免疫显性肽表位的呈递。

将细胞悬液静脉注射至已致敏的小鼠体内。

注射的细胞会迁移至含有免疫细胞群（包括细胞毒性T淋巴细胞或CTLs）的脾脏。

在脾脏内，CTLs 与靶细胞的表位相互作用。

免疫优势表位具有更强的免疫原性，可触发强烈的CTL免疫反应，释放细胞毒性物质，导致高强度的荧光细胞裂解。

取出小鼠脾脏并进行机械性破碎。加入裂解缓冲液以去除红细胞，过滤悬浮液。

离心并重悬细胞沉淀。

使用荧光激活细胞分选仪对细胞进行分选。与中等和低强度荧光细胞相比，高强度荧光细胞数量的减少证实了细胞毒性T淋巴细胞反应中的免疫优势现象。

对于靶细胞的注射，首先轻轻涡旋混合各来源管，按等比例将三种CFSE标记的细胞悬液合并至一个新的离心管中。用无菌PBS补足体积，通过离心收集细胞并进行计数。随后，将细胞悬液调整至每200微升PBS中含有1×10⁷个混合的靶细胞，并为每只受体C57-Black-6小鼠经尾静脉注射200微升该细胞悬液。

注射后2小时或4小时，按照示范操作取出并处理每只受体动物的脾脏，将分离的白细胞重悬于每脾脏3毫升PBS中。从每份处理后的脾脏中转移约1×10⁷个细胞至一洁净的FACS管中，并立即按照示范操作在流式细胞仪上检测，以圈定CFSE低、中、高表达的靶细胞群体。

然后，在荧光一通道中总共获取 2,000 个 CFSE 低事件，并根据文中详述的公式计算每种同源靶细胞群体的特异性裂解率。