基质细胞对白细胞募集影响的体外流动研究

取已组装并与流动系统连接的Transwell小室，其中一个小室上层为内皮细胞单层培养，另一个小室上层为内皮细胞培养、下层为基质细胞培养。

两个腔室均预先用一种促炎性细胞因子处理。

在单层培养中，细胞因子激活内皮细胞，上调黏附分子的表达。

然而，共培养体系中基质细胞与内皮细胞之间的串扰会导致基质细胞产生调控性介质，从而下调内皮细胞对促炎性细胞因子的反应。

将培养室置于倒置相差显微镜载物台上。

加入中性粒细胞悬液。

中性粒细胞被招募并结合至内皮黏附分子 通过 短暂的黏附相互作用，促进其与表面结合的趋化因子相互作用，并沿内皮细胞滚动。

这种相互作用会激活中性粒细胞上的整合素，稳定黏附，并导致其穿过内皮细胞发生跨膜迁移。

然而，在共培养条件下，内皮细胞反应的下调导致中性粒细胞募集受到抑制。

在相差显微镜下观察培养物，以评估中性粒细胞从流动中的募集情况。

对于滤膜模型，首先使用金属模板将一片Parafilm裁剪成与玻璃盖玻片相同尺寸。然后，使用金属模板在Parafilm上切割出一个20毫米×4毫米的槽，以形成流动通道。用Parafilm垫圈在玻璃盖玻片上标记出流动通道的位置。将六孔滤膜的边缘与玻璃盖玻片上的标记对齐，确保滤膜覆盖流动通道的标记区域。使用10A型手术刀小心地切割出滤膜。

接下来，小心地用封口膜垫圈覆盖滤膜，确保流道槽位于滤膜中央。使用一片干净的纸巾，挤出所有气泡。然后，将盖玻片放入有机玻璃流动室底板的凹槽中。

将顶部的有机玻璃板置于垫圈上方，并用螺丝将两块板固定在一起。旋转三通阀，使 PBS-A 洗涤缓冲液流经阀门。然后，将压力计管路连接到顶部有机玻璃板的进液口。让 PBS-A 流经流道，以使气泡排出。

然后将注射泵的测压管连接到有机玻璃板的出口端口。清除滴到腔室上层板上的任何PBS-A液体。最后，将腔室放置在倒置相差显微镜的载物台上，并调节焦距以观察滤膜上方的内皮细胞。

为了将白细胞灌注到内皮细胞上，先将注射泵设置为重新填充，然后按运行。待调整焦距以清晰观察内皮细胞单层后，将2毫升纯化的中性粒细胞加入样品储液器中，并静置预热2分钟。随后，用PBS-A冲洗内皮层2分钟。打开阀门，使中性粒细胞灌注过内皮层。持续输送中性粒细胞团注4分钟。关闭阀门，并从清洗储液器中继续灌注PBS-A直至实验结束。

进行实验时，需确保在检测过程中的任何阶段均无气泡通过，因为气泡会破坏内皮细胞单层，导致黏附的中性粒细胞脱落。

使用数字图像采集软件，在中性粒细胞流动过程中或灌注后记录中性粒细胞的募集情况。通过将物镜移至入口端口处通道的边缘并确定端口的中心位置，来识别通道的中心。在流动通道中心区域至少采集5到10个视野的数字图像记录。

在记录中性粒细胞流动过程中，每隔10秒拍摄一个视野的图像，持续1分钟。沿通道移动，再记录另一个视野1分钟，重复此过程直至整个团注结束。

灌注后记录时，在流动通道中心区域选择5到10个视野，每个视野记录10秒，用于评估白细胞行为。在10秒的时间内，每隔1秒采集一次图像。这足以提供从流动中捕获细胞的时间，并可用于分析黏附中性粒细胞的行为。

记录一个包含至少10个已迁移中性粒细胞的视野，持续5分钟，每30秒拍摄一次图像。该记录可用于计算迁移细胞的迁移速度。另记录一系列持续10秒的视野，以允许中性粒细胞有足够时间穿过内皮单层。

最后，停止注射泵，取下出口管路，然后取下入口管路。拆卸流式腔室，并用 PBS-A 冲洗样品储液池。在进行后续分析白细胞募集和行为之前，对后续的滤膜和微载玻片通道重复上述步骤，具体操作详见文本方案。