基于流式细胞术的治疗诱导的衰老癌细胞定量

0 次观看4:19 分钟 • July 8th, 2025

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以用化疗药物预处理的癌细胞为例,该药物会诱导一定比例的细胞衰老。

这些细胞积累自发荧光脂褐质颗粒,这是一种已知的衰老标志物。

添加一种抗生素,进入细胞并抑制溶酶体质子泵,防止溶酶体酸化。

pH 值的升高使溶酶体酶失活。

即使在

接近中性的 pH 值下,衰老细胞也会过度表达溶酶体 β-半乳糖苷酶,使其成为衰老生物标志物。

引入β-半乳糖苷酶底物。孵化。

β-半乳糖苷酶将内化底物水解成荧光产物,标记衰老细胞。

心并丢弃上清液。

添加细胞活力染料。在活细胞内,活性酯酶将染料转化为膜不透的荧光产物。膜完整性受损的死细胞保持未染色。

使用流式细胞术检测显示双重标记脂褐质和荧光β-半乳糖苷酶底物的活细胞,表明衰老细胞。

量化衰老细胞的百分比以证明药物疗效。

首先,通过将DMEM中一微摩尔巴非洛霉素A的溶液以每毫升10倍至第6个细胞的浓度加入细胞沉淀中,调节培养细胞样品的溶酶体pH值,并移液混合。在37摄氏度下在旋转器上以慢速孵育30分钟。然后,为了染色衰老相关的β-半乳糖苷酶,将每毫升10微克的DDAOG储备溶液加入样品中,无需洗涤。

放在旋转器上 60 分钟,避免直射光。和以前一样,离心试管。除去上清液,并在PBS中用一毫升冰冷的0.5%BSA洗涤沉淀。然后,将 300 微升稀释的煅烧紫 450 AM 溶液加入洗涤的细胞沉淀中。在黑暗中在冰上孵育 15 分钟。

细胞样品转移到流式细胞术仪器兼容管中。在数据采集软件中,打开紫色通道直方图和远红通道与绿色通道点点图。以低进气速度启动细胞仪数据采集,并将用 DDAOG 染色的阳性对照样品放在进气口上。开始采集样本数据。调整通道电压,使每个图中包含 90% 以上的事件。

当所有设置都处于最佳状态时,每个样本记录 10,000 个事件。将沾有 DDAOG 染色的车辆专用对照样品放在进气口上。启动数据采集并记录每个样本 10,000 个事件。与阳性对照相比,寻找自发荧光或 AF 和 DDAO 半乳糖苷信号的增加。将示例数据保存在 .FCS 文件格式,并将文件导出到配备流式细胞术分析软件的工作站计算机。

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最后更新:1 八月 2026