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取一个平底多孔板,孔内含有在生长培养基中或在添加了胆盐的生长培养基中的细菌。
胆盐引发应激反应,导致细胞损伤并释放DNA和蛋白质。这些生物分子覆盖在孔板底部,使存活的细菌能够黏附于固体表面。
附着的细菌会增殖,形成微菌落,并产生自诱导剂——即化学信号分子,从而实现细菌间的通讯。
这种信号会触发细菌定植并启动胞外聚合物(EPS)的产生,从而形成生物膜。
孵育结束后,移除培养基以去除游离的细菌。
加入结晶紫染料,该染料与细菌细胞壁中的肽聚糖相互作用,使其呈现紫色。
去除多余的染料并干燥。加入乙醇覆盖,使结晶紫从细菌细胞壁中溶解,溶液颜色随之改变。
胆盐处理孔中比未处理孔中颜色更深,表明通过固相黏附形成了生物膜。
首先,将两个 1.5 毫升离心管分别标记为 TSB 和 TSB 加 BS。然后,向对应的离心管中分别加入 1 毫升 TSB 或 TSB 加 BS。
接下来,取20微升过夜培养物以1:50的比例接种到各试管中。然后,向一个无菌、透明、平底、经组织培养处理的96孔板中的三个孔内,每孔加入130微升未接种的对照培养基。此为空白对照。
向三个孔中每个孔加入130微升接种的培养物。在相应孔中加入对照和接种的培养物后,将96孔板在37摄氏度下静置培养4至24小时。培养结束后,在酶标仪上将对照孔设为空白。
接下来,从每个孔中吸除培养基。然后用 200 微升无菌 PBS 轻柔地洗涤各孔一次。洗涤后,吸除 PBS,将培养板倒置于吸水纸上,静置干燥约 20 分钟。
确保轻柔地移除培养基并进行轻柔清洗,以避免干扰胞外多糖基质,这一点非常重要。
接下来,向每个实验孔和对照孔中加入150微升0.5%的结晶紫溶液。然后在室温下孵育5分钟。5分钟后,用400微升蒸馏水洗涤各孔一次。再加入200微升蒸馏水,重复洗涤5次。完成全部5次洗涤后,将培养板倒置,避光完全晾干。
为了获得一致的结果,在继续操作之前,必须确保样品已彻底干燥。
待平板完全干燥后,使用 200 微升 95% 乙醇对孔进行脱色。然后将平板置于摇床上,在 4 摄氏度下孵育 30 分钟,以避免蒸发。30 分钟后,在酶标仪上记录 OD540 值。