一种通过胞外多糖基质检测研究胆盐诱导生物膜形成的实验方法

取一个含有在生长培养基中的致病性肠道细菌的多孔板。

所选孔中的培养基含有胆盐——即具有类似洗涤剂活性的两亲性分子——以模拟严苛的生长条件。

胆盐会破坏细菌膜，并对DNA和蛋白质造成损伤。

作为一种应对机制，细菌会形成生物膜 ——这是一种由自身产生的胞外聚合物基质包裹的结构化细菌群落，该基质称为EPS，包含多糖、蛋白质、脂类以及微生物来源的核酸。

EPS 层使细菌免受胆盐的暴露。

孵育结束后，吸出培养基以去除未贴壁的细菌。

使用固定缓冲液处理以保存生物膜的结构，并进行洗涤以去除多余的缓冲液。

加入荧光标记的刀豆蛋白A  — 一种可结合EPS多糖的凝集素，用于标记生物膜。洗涤以去除多余的刀豆蛋白A。

使用酶标仪测量荧光。含有胆盐的孔中荧光强度越高，表明胆盐诱导的生物膜形成越明显。

为了对EPS进行半定量检测，使用多通道移液器将培养基转移至透明的96孔板中。然后，加入200微升固定试剂，在室温下固定黑色孔板15分钟。接着，将对照孔设为空白对照，测定OD600读数以进行标准化。随后，在贴壁菌群固定的同时，记录培养基的读数。

固定完成后，移除固定液并将其弃置至有害废物容器中。随后，用 200 µL 无菌 PBS 轻柔地洗涤孔板两次。洗涤后，吸去 PBS。接着，向每个孔中加入 150 µL 浓度为 25 µg/mL 的 ConA-FITC 溶液。将孔板在室温下孵育 15 分钟。孵育结束后，用 200 µL PBS 轻柔洗涤孔板。然后，向每个孔中加入 150 µL PBS，并在 488 nm 处记录荧光信号。