一种用于制备样本以观察菌丝上生物膜形成细菌的方法

将一个置于玻璃纸上的真菌菌落引入荧光标记的细菌悬液中。移除玻璃纸后进行孵育。

细菌细胞附着在真菌表面 通过 表面分子和受体。黏附的细菌分泌由多糖、蛋白质和DNA组成的胞外聚合物，捕获细菌细胞并形成生物膜的结构基础。

用高浓度盐溶液冲洗切片，以去除松散结合的细菌

在磷酸盐缓冲液中，切取菌落的一部分。

将切片转移至含有与红色荧光染料偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）的无菌水中。

WGA 是一种植物蛋白，可结合 N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸残基，从而使连接的染料在真菌细胞壁上产生荧光。

用磷酸盐缓冲液冲洗切片。

将载玻片部分浸入缓冲液中，使切片在液面上自然漂浮。轻轻提起载玻片，使切片平稳附着，避免生物膜结构受到破坏。

加入封片剂，然后盖上盖玻片用于显微镜分析。

细菌过夜培养后，于5,000 × g 离心3分钟，将菌体沉淀重悬于25毫升无菌的0.1摩尔磷酸钾缓冲液中。重复离心后，用相同的缓冲液将最终细菌浓度调整至每毫升10⁹个细胞。

向6孔细胞培养板中加入5毫升细菌悬液。使用无菌剃刀片将真菌培养物的玻璃纸膜切成若干小方块，每块玻璃纸膜上含一个菌落。然后用镊子小心地从固体培养基上取下带有菌丝的玻璃纸方块，并将其转移至细菌悬液的各个孔中。

轻轻振荡微孔板，直至真菌菌落从玻璃纸膜上脱落。随后移除玻璃纸膜，使真菌菌落留在微孔板中。根据所用菌株及待分析的发育阶段，在20 °C下以轻微振荡培养微孔板一定时间。

对于 P. fluorescens BBc6/L. bicolor，培养 30 分钟以获得早期生物膜，培养长达 16 小时以获得成熟生物膜。为去除浮游细菌以及通过静电作用附着在菌丝上的细菌，将真菌转移至装有高盐溶液的新 6 孔微孔板中进行冲洗。轻轻振荡 1 分钟。

将真菌转移至一个新的6孔微孔板中，该微孔板含有5毫升无菌的0.1摩尔磷酸钾缓冲液。轻轻振荡平板2分钟，然后将真菌转移至新鲜缓冲液中。

将真菌菌落保持在缓冲液中的同时，使用解剖刀将菌落大致切成两半。取其中一半转移至含有1毫升无菌水的培养皿中，水中需添加适量的荧光染料以观察真菌网络结构，例如与Alexa Fluor633偶联的小麦胚芽凝集素。随后，将样品避光孵育。

染色后，将样本转移至含有10毫升无菌0.1摩尔磷酸钾缓冲液的培养皿盖中，轻轻振荡1分钟以清洗。将载玻片一半浸入培养皿盖的缓冲液中，小心地使切片漂浮于载玻片上方。然后，缓慢将载玻片从缓冲液中提起，使样本轻柔地沉降在载玻片上。

最精细的步骤是将样品放置在载玻片上的过程。为避免生物膜被破坏，在放置样品时必须将样品和载玻片同时浸入液体中，并且在成像前不得再移动样品。

最后，向样品中加入 10 µL 抗荧光淬灭封片剂，并加盖盖玻片。