利用共聚焦显微镜实时分析不同肿瘤区域中驻留T细胞的迁移

0 次观看4:23 分钟 • July 8th, 2025

从含有驻留性T细胞的肺肿瘤切片开始。

T细胞在肿瘤微环境中迁移,并与肿瘤细胞和基质成分相互作用,发挥免疫功能。

肿瘤微环境的组成对T细胞的位移和速度具有显著影响。

加入不同的荧光标记抗体,以标记微环境中的T细胞、肿瘤细胞和基质成分。

加入DAPI,该染料可穿透质膜受损的细胞并染色细胞核,从而实现对肿瘤内坏死区域的可视化观察。

在共聚焦显微镜下观察染色后的样本。

使用合适的荧光光源,选择含有驻留T细胞的肿瘤感兴趣区域。通过评估DAPI阳性细胞来判断细胞活力。

进行实时分析时,定义时间间隔和总记录时间。

为了获取Z轴层扫图像,从标记的T细胞下方的深度开始,并在不同时间间隔拍摄图像。

利用追踪软件比较不同肿瘤区域中T细胞的位移长度和平均速度。

将所需荧光标记的抗体和荧光核染料 DAPI 用不含酚红的 RPMI 培养基稀释至所需的终浓度。随后,从培养箱中取出培养板,使用细尖吸头吸除不锈钢洗涤圈内的液体。

现在,在不触碰切片的情况下,向每张肿瘤切片上加入40微升稀释后的抗体。为进行染色,将培养板置于37摄氏度孵育15分钟。染色步骤完成后,使用精细镊子移除洗涤垫。然后,轻轻取出切片,并将其浸入不含酚红的RPMI1640培养基中10秒。将切片重新放回细胞培养插入物上,并在每张切片上加一滴不含酚红的RPMI1640培养基。将培养板在37摄氏度孵育10分钟,随后进行成像分析。

在开始本实验前数小时,将显微镜加热腔室的温度设定为 37 摄氏度,随后准备显微镜装置,以持续用含氧的无酚红 RPMI 培养基灌注肿瘤切片,并通过蠕动泵将溶液抽吸至废液收集瓶中。

借助精细镊子将染色的切片从六孔板中取出,转移至盛有不含酚红的RPMI培养基的35毫米塑料培养皿中,然后在切片上放置切片固定锚以支撑切片。接着,将该培养皿置于显微镜的成像载物台上。

连接灌流系统的进液端和出液端后,启动蠕动泵,使含氧培养基流经灌流管路。将水浸物镜降至脑片上方,使用明场光或适当波长的光源对脑片表面进行聚焦。

然后,使用适当的滤光片观察并选择一个包含所有目标荧光标记细胞的感兴趣区域,即 CD8 T 细胞、肿瘤小岛以及 CD90 阳性基质细胞。根据观察到的荧光信号亮度,设置合适的激光强度和曝光时间以建立成像条件。随后,设定 Z-stack 厚度,以便对肿瘤切片内部进行成像。

接下来,选择 Z轴扫描 图像时间间隔和总记录时间,以特定时间间隔采集图像。在采集并导出荧光图像后,按照文本方案中所述分析CD8 T细胞迁移。

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最后更新:29 八月 2026