Why does FACS quantification of green fluorescence matter for Tau uptake?

FACS measures green fluorescence intensity from pH-sensitive dye-labeled Tau aggregates, which increases upon phagocytosis and endolysosomal acidification. This provides a quantitative, single-cell readout of microglial Tau internalization. The assay enables objective comparison of uptake across experimental conditions.

How does immunocomplex formation enable specific Tau uptake measurement?

Antibodies bind phosphorylated Tau aggregates to form immunocomplexes that engage microglial Fc receptors, directing phagocytosis. This mechanism ensures that measured fluorescence reflects receptor-mediated uptake of pathogenic Tau species. The approach models opsonized Tau clearance relevant to immunotherapy mechanisms.

What does trypsin-EDTA treatment achieve before FACS analysis?

Trypsin-EDTA detaches microglia from the plate while preserving internalized endolysosomes and their fluorescent cargo. Cells are then washed and resuspended in FACS buffer for analysis. This step ensures only cell-associated fluorescence is measured, excluding surface-bound immunocomplexes.

Why are washing steps critical after immunocomplex incubation?

Washes remove non-internalized immunocomplexes to prevent false-positive fluorescence signals. This step isolates the signal from truly phagocytosed Tau aggregates. Stringent washing improves assay specificity and reproducibility across replicates.

How does endolysosomal acidification enable fluorescence detection?

The pH-sensitive dye remains neutral at physiological pH but fluoresces in the acidic environment of the endolysosome after phagocytosis. Fluorescence intensity thus correlates with the delivery of Tau aggregates to degradative compartments. This mechanism allows discrimination between surface binding and true internalization.

一种基于细胞的测定法，用于评估小胶质细胞对 tau 蛋白的摄取

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

0 次观看 • 5:22 分钟 • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从一个平底多孔板开始，该板含有粘附的小鼠小胶质细胞——大脑中的吞噬细胞。

引入含有免疫复合物的无血清培养基。这些复合物由附着在磷酸化 Tau 蛋白聚集体上的抗体组成，这些蛋白聚集体是在某些神经退行性疾病期间形成的。

Tau聚集体用pH敏感的绿色荧光染料标记。

在

孵育过程中，这些免疫复合物与小胶质细胞的 Fc 受体相互作用，促进它们的吞噬。

这种含有免疫复合物的内体与溶酶体融合，形成内溶酶体。内溶酶体的酸性环境导致染料分子发出荧光。

洗涤以去除未内化的免疫复合物。

用胰蛋白酶-EDTA溶液处理以分离细胞。

将

细胞悬液转移到位于冰上的U型底板上，以稳定内溶酶体。沉淀细胞并丢弃上清液。

用

FACS缓冲液洗涤并重悬细胞。

使用 FACS，识别单个活细胞并量化绿色荧光强度，以评估小胶质细胞对 Tau 的摄取。

在实验的第一天，首先在培养它们的烧瓶中用1x PBS洗涤BV-2细胞来制备BV-2细胞。然后，将它们与 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 在 37 摄氏度和 5% CO₂ 下孵育，直到它们从烧瓶中分离出来。通过上下移液 3 至 5 次将细胞重悬于培养基中。

在

含有200微克/毫升肝素的培养基中计数细胞并制备终浓度为每毫升100,000个细胞的细胞悬液。在 96 孔组织培养平底板中每孔加入 250 微升该细胞悬液。将板与 5% CO₂在 37 摄氏度下孵育过夜。

在

冰上解冻先前制备的pH染料-Tau聚集体后，根据无血清培养基的条件将它们稀释在65微升中，制成500纳摩尔溶液。在 65 微升无血清培养基中稀释抗体，以达到所需浓度的两倍。在 96 孔 U 底板中混合 pH 染料 Tau 聚集体和抗体。密封该稀释板并在 37 摄氏度下孵育过夜。

第二天，从含有 BV-2 细胞的 96 孔板中取出培养基。用 100 微升室温 1x PBS 洗涤每个孔中的细胞。从 BV-2 细胞板中取出 PBS。使用多通道移液器将 125 微升免疫复合物从稀释板转移到 96 孔 BV-2 细胞板的每个孔中，并在 37 摄氏度下与 5% CO₂ 孵育两小时。

孵育后，从细胞中取出免疫复合物，并用 100 微升室温 1x PBS 洗涤每个孔中的细胞。去除 1x PBS 后，加入 50 微升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，并在 37 摄氏度下与 5% CO₂ 孵育 20 分钟。之后，加入200微升培养基，并通过上下移液以分离细胞来重悬孔。

将

相关视频

0 观看次数

最后更新：1 八月 2026

一种基于细胞的测定法，用于评估小胶质细胞对 tau 蛋白的摄取

概述

关键研究组成部分

科学领域

背景

研究目的

所用方法

主要结果

结论

常见问题

Executive Industry Relevance

Strategic Applications in Biopharma R&D

Early Discovery & Target Validation

Screening & Assay Development

Translational & Preclinical Research

Pipeline & Workflow Integration

Operational & Enterprise Impact

Implementation Considerations

Biopharma FAQs

体外骨髓源性巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬

一种新的体外活体成像法测定星形胶质细胞的吞噬作用 pH 指标-共轭突

利用生命病毒介导的人神经元转导研究头塔聚集的体外模型

小胶质细胞吞噬作用测定:一种使用 iPSC 巨噬细胞建立神经母细胞瘤细胞小胶质细胞吞噬模型的体外测定

一种检测 tau 种子诱导的报告蛋白聚集的 FRET 流式细胞术技术

一个吞噬含量:一个协议，以评估之间的中枢神经系统吞噬细胞和神经元的相互作用

与FRET流式细胞仪灵敏地检测Proteopathic播种活动

小胶质细胞作为替代生物传感器确定纳米颗粒神经毒性

评估视网膜小胶质细胞吞噬功能在体内使用基于流式细胞术流量测定

在体外陶氏蛋白聚集与药物筛选研究方法