一种基于细胞的测定法，用于评估小胶质细胞对 tau 蛋白的摄取

从一个平底多孔板开始，该板含有粘附的小鼠小胶质细胞——大脑中的吞噬细胞。

引入含有免疫复合物的无血清培养基。这些复合物由附着在磷酸化 Tau 蛋白聚集体上的抗体组成，这些蛋白聚集体是在某些神经退行性疾病期间形成的。

Tau聚集体用pH敏感的绿色荧光染料标记。

孵育过程中，这些免疫复合物与小胶质细胞的 Fc 受体相互作用，促进它们的吞噬。

这种含有免疫复合物的内体与溶酶体融合，形成内溶酶体。内溶酶体的酸性环境导致染料分子发出荧光。

洗涤以去除未内化的免疫复合物。

用胰蛋白酶-EDTA溶液处理以分离细胞。

细胞悬液转移到位于冰上的U型底板上，以稳定内溶酶体。沉淀细胞并丢弃上清液。

FACS缓冲液洗涤并重悬细胞。

使用 FACS，识别单个活细胞并量化绿色荧光强度，以评估小胶质细胞对 Tau 的摄取。

在实验的第一天，首先在培养它们的烧瓶中用1x PBS洗涤BV-2细胞来制备BV-2细胞。然后，将它们与 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 在 37 摄氏度和 5% CO₂ 下孵育，直到它们从烧瓶中分离出来。通过上下移液 3 至 5 次将细胞重悬于培养基中。

含有200微克/毫升肝素的培养基中计数细胞并制备终浓度为每毫升100,000个细胞的细胞悬液。在 96 孔组织培养平底板中每孔加入 250 微升该细胞悬液。将板与 5% CO₂ 在 37 摄氏度下孵育过夜。

冰上解冻先前制备的pH染料-Tau聚集体后，根据无血清培养基的条件将它们稀释在65微升中，制成500纳摩尔溶液。在 65 微升无血清培养基中稀释抗体，以达到所需浓度的两倍。在 96 孔 U 底板中混合 pH 染料 Tau 聚集体和抗体。密封该稀释板并在 37 摄氏度下孵育过夜。

第二天，从含有 BV-2 细胞的 96 孔板中取出培养基。用 100 微升室温 1x PBS 洗涤每个孔中的细胞。从 BV-2 细胞板中取出 PBS。使用多通道移液器将 125 微升免疫复合物从稀释板转移到 96 孔 BV-2 细胞板的每个孔中，并在 37 摄氏度下与 5% CO₂ 孵育两小时。

孵育后，从细胞中取出免疫复合物，并用 100 微升室温 1x PBS 洗涤每个孔中的细胞。去除 1x PBS 后，加入 50 微升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，并在 37 摄氏度下与 5% CO₂ 孵育 20 分钟。之后，加入200微升培养基，并通过上下移液以分离细胞来重悬孔。

细胞转移到 96 孔 U 型底板上，并在 4 摄氏度下以 400 倍 g 离心 5 分钟。将盘子放在冰上并取出培养基。加入150微升冰冷的1x PBS，在4摄氏度下再次以400g离心5分钟。将板放在冰上，通过去除先前添加的 1x PBS 并每孔加入 150 微升冰冷 PBS 再次洗涤。在相同条件下再次离心。

将板放在冰上，通过去除先前添加的PBS并每孔加入150微升FACS缓冲液来洗涤细胞。在4摄氏度下再次以400g离心5分钟。将板放在冰上，取出先前添加的FACS缓冲液，并将细胞重悬于每孔200微升FACS缓冲液中。立即进行FACS分析，在活细胞门中获取20,000个事件。