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免疫学
0 次观看 • 5:22 分钟 • July 8th, 2025
从一个平底多孔板开始，其中含有贴壁的小鼠小胶质细胞——脑内的吞噬细胞。
加入含有免疫复合物的无血清培养基。这些复合物由附着在磷酸化Tau蛋白聚集体上的抗体组成，而磷酸化Tau蛋白聚集体是在某些神经退行性疾病过程中形成的。
使用一种对 pH 敏感的绿色荧光染料标记 Tau 聚集体。
孵育期间，这些免疫复合物与小胶质细胞的Fc受体相互作用，促进其吞噬。
含有该免疫复合物的内体与溶酶体融合，形成内溶酶体。内溶酶体的酸性环境导致染料分子发出荧光。
洗涤以去除未内化的免疫复合物。
使用胰蛋白酶-EDTA 溶液处理以消化细胞。
将细胞悬液转移至置于冰上的U型底培养板中，以稳定内体-溶酶体。离心收集细胞沉淀，并弃去上清液。
用FACS缓冲液洗涤细胞并重悬。
利用流式细胞术（FACS），鉴定单个活细胞并定量绿色荧光强度，以评估小胶质细胞对Tau蛋白的摄取。
在实验第一天，首先用1×PBS清洗培养瓶中的BV-2细胞。随后，在37摄氏度、5% CO2条件下，用0.05%胰蛋白酶EDTA孵育细胞，直至其从培养瓶壁脱落。通过上下吹打3至5次，将细胞重悬于培养基中。
计数细胞，并用含有200微克/毫升肝素的培养基制备细胞悬液，终浓度为每毫升10万个细胞。每孔加入250微升该细胞悬液至96孔平底组织培养板中。将培养板置于37摄氏度、5% CO2条件下孵育过夜。
将预先制备的pH染料-Tau聚集体在冰上解冻后，用无血清培养基稀释至每孔65微升，配制成500纳摩尔的溶液。将抗体用65微升无血清培养基稀释，使其浓度达到目标浓度的两倍。在96孔U型底板中混合pH染料-Tau聚集体与抗体。密封该稀释板，并在37摄氏度下孵育过夜。
第二天，从含有 BV-2 细胞的 96 孔板中移除培养基。用 100 微升室温的 1× PBS 洗涤每个孔中的细胞。从 BV-2 细胞板中移除 PBS。使用多通道移液器将 125 微升免疫复合物从稀释板转移至 96 孔 BV-2 细胞板的每个孔中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2 小时。
孵育结束后，从细胞中去除免疫复合物，每孔加入 100 微升室温的 1× PBS 洗涤细胞。吸除 1× PBS 后，每孔加入 50 微升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 摄氏度、5% CO2 条件下孵育 20 分钟。随后，加入 200 微升培养基，通过上下吹打重悬细胞，使细胞脱离培养板。
将细胞转移至96孔U型底板中，在4摄氏度下以400 × g 离心5分钟。将板置于冰上，吸除上清液。每孔加入150微升预冷的1×PBS，再在相同条件下以400 × g 离心5分钟。将板放回冰上，吸除之前加入的1×PBS，每孔重新加入150微升预冷的PBS，再次在相同条件下离心。
将培养板置于冰上，弃去先前加入的 PBS，每孔加入 150 微升 FACS 缓冲液进行细胞洗涤。在 4 摄氏度下以 400 g 离心 5 分钟。将培养板重新置于冰上，弃去先前加入的 FACS 缓冲液，每孔用 200 微升 FACS 缓冲液重悬细胞。立即进行 FACS 分析，获取活细胞门内的 20,000 个事件。