用于多肽脱盐和纯化的 STAGE Tip 程序

使用 STop And Go Extraction 或 STAGE Tip，一种小型化纯化柱。

尖端含有键合在长烃链上的小二氧化硅珠，用于基于疏水相互作用的肽纯化。

用含有高比例乙腈的缓冲液洗涤，去除树脂杂质。

引入结合缓冲液和离心机，平衡色谱柱以获得最佳肽结合。

加载从分化的中性粒细胞样细胞中获得的预消化肽样品，其中含有肽片段和杂质，包括盐。

心使样品通过色谱柱。肽片段通过疏水相互作用与碳氢化合物链结合，同时去除盐。

加入结合缓冲液并离心，去除剩余的杂质。

引入含高乙腈的缓冲液进行洗脱。

使用注射器，将缓冲液穿过色谱柱。乙腈与碳氢化合物链结合，取代用缓冲液洗脱的肽片段。

进行蛋白质组学分析以鉴定纯化的肽。

首先，将三层 C18 树脂包装在 200 微升移液器吸头中，为每个肽样品构建 STop And Go 提取或 STAGE 吸头。

通过加入 1 x 10 体积的终止溶液来停止先前孵育的肽样品的酶消化。以 13,200 rpm 离心样品 10 分钟，然后将上清液转移到新的 2 毫升管中。

接下来，用 100 微升 100% 乙腈清洗 STAGE 吸头，并将 STAGE 吸头以 1000 g 离心 2 分钟或直到所有液体都通过 C18 树脂。

用 50 微升缓冲液 B 重复 STAGE 吸头洗涤，然后用相同的离心条件使用 200 微升缓冲液 A。

样品加载到 STAGE 吸头中，以 1000 g 离心 3 至 5 分钟。然后，用 200 微升缓冲液 A 洗涤 STAGE 吸头，以 1000 g 离心 3 至 5 分钟。

接下来，将 50 微升缓冲液 B 加入每个 STAGE 吸头中，并使用注射器将含有缓冲液 B 的样品洗脱到 0.2 毫升 PCR 管中。

脱后，使用真空离心机将肽干燥 45 分钟。在文本手稿中描述的条件下在高分辨率质谱法上运行样品。

要处理数据以进行蛋白质组学分析，请将从质谱法获得的原始数据文件上传到 MaxQuant 软件中。有关软件的所有参数及其调整，请参阅文本手稿。

在全局参数中，导入从Uniprot数据库下载的智人的FASTA文件进行序列鉴定，记录生物体ID，蛋白质数量和文件下载日期。

设置要处理的计算机内核数，然后选择"开始"。完成 MaxQuant 后，将生成一个"组合"文件夹以及上传到数据存储库所需的其他文件。

要分析数据，请将"proteingroups.txt"上传到 Perseus 中，然后选择所有无标记定量或 LFQ 强度文件到"主"窗口。通过去除污染物、反向肽和仅按位点识别的肽来过滤行，并通过 log₂（x） 转换数据。

要观察每次重复中检测到的蛋白质数量，请构建一个数字维恩图，并通过为一个生物样品的所有重复提供相同的名称来为每个样品设置分类注释。

有效值过滤行，在超过 50% 的重复中和至少一组中鉴定出蛋白质。要替换 LFQ 的缺失值，请根据正态分布执行插补。

在"bin"、"conf"和"annotation"文件夹中添加txt.gz FASTA 文件，将从 Perseus 网站下载的注释信息添加到蛋白质行中。引入特定术语，如蛋白质名称、基因名称和基因本体。

该矩阵现已完成，可以在主成分分析图、热图和类别丰富等工具中进行可视化。执行统计测试以确定测试条件之间蛋白质丰度的显着变化。