一种用于肽段脱盐与纯化的STAGE Tip操作流程

取一个STop And Go Extraction（STAGE）Tip，即一种微型化纯化柱。

提示：该小柱含有与长链烃基共价结合的微小二氧化硅珠，用于基于疏水相互作用的多肽纯化。

使用含有高比例乙腈的缓冲液洗涤，以去除树脂杂质。

加入结合缓冲液并进行离心，使柱子平衡，以实现最佳的肽段结合。

加载从分化的类中性粒细胞中获得的预先消化的肽样品，其中含有肽片段及杂质（包括盐类）。

离心使样品通过层析柱。肽段片段与碳氢链结合。 通过 疏水相互作用，同时去除盐分。

加入结合缓冲液并离心，以去除残留的杂质。

引入含有高浓度乙腈的缓冲液进行洗脱。

使用注射器将缓冲液通过色谱柱。乙腈会结合到烃链上，置换出随缓冲液洗脱的肽段片段。

进行蛋白质组学分析以鉴定纯化的肽段。

首先，在每个肽样品的 200 微升移液枪头中填充三层 C18 树脂，以构建串联固相萃取或称为 STAGE 小柱。

通过加入1/10体积的终止溶液，终止先前孵育的肽样品的酶解反应。将样品在13,200 rpm下离心10分钟，并将上清液转移至新的2毫升离心管中。

接着，用 100 微升 100% 乙腈洗涤 STAGE 小柱，并在 1000 g 离心 2 分钟或直至所有液体通过 C18 树脂。

用50 µL缓冲液B重复进行STAGE吸头清洗，随后用200 µL缓冲液A清洗，离心条件相同。

将样品加入STAGE小柱中，在1000 g 离心3至5分钟。随后，加入200微升缓冲液A，于1000 g 离心3至5分钟，洗涤STAGE小柱。

接下来，向每个STAGE尖端中加入50微升缓冲液B，并使用注射器将含有缓冲液B的样品洗脱至0.2毫升PCR管中。

样品洗脱后，使用真空离心机干燥肽段，持续45分钟。根据文本稿件中描述的条件，采用高分辨率质谱对样品进行分析。

为了进行蛋白质组学分析的数据处理，将质谱获得的原始数据文件上传至 MaxQuant 软件。有关该软件及其参数设置的所有细节，请参阅文本稿件。

在全局参数中，从 Uniprot 数据库导入用于序列鉴定的智人（Homo sapiens）FASTA 文件，并记录该文件的物种 ID、蛋白质数量及下载日期。

设置用于处理的计算机核心数量，然后选择开始。MaxQuant 完成后，将生成一个“合并”文件夹，以及上传至数据存储库所需的其他文件。

为分析数据，将 'proteingroups.txt' 文件上传至 Perseus，并将所有非标记定量或 LFQ 强度文件导入 'Main' 窗口。通过去除污染物、反向肽段以及仅由位点鉴定出的肽段来筛选行，并对数据进行 log₂(x) 转换。

为了观察每个重复样本中检测到的蛋白质数量，构建一个数值型维恩图，并通过为同一生物样本的所有重复设置相同的名称，来为每个样本添加分类注释。

根据有效值筛选行，要求蛋白质在超过50%的重复实验中被鉴定到，并且至