评估功能性 SARS-CoV-2 中和抗体

从连续稀释的人血清开始，该血清含有不同浓度的针对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒 2 或 SARS-CoV-2 的中和抗体。

引入具有荧光素酶 RNA、整合酶和逆转录酶的假型病毒，封装在含有 SARS-CoV-2 刺突蛋白的脂质双层中。

抗体根据血清稀释度中和病毒，较低的稀释度表现出最大的中和效果。

引入表达血管紧张素转换酶-2受体或ACE2受体和跨膜蛋白酶丝氨酸-2或TMPRSS2的靶细胞。

在较高的血清稀释度中，未中和的病毒与 ACE2 受体相互作用，而TMPRSS2裂解刺突蛋白，从而实现病毒融合。

进入后，荧光素酶 RNA 被逆转录为 DNA，整合到宿主基因组中并产生荧光素酶。

含有荧光素酶底物和裂解剂的测定缓冲液代替培养基。

细胞裂解，释放细胞内荧光素酶，与底物相互作用并产生高发光。

量化血清稀释液的发光，以确定病毒中和百分比 — 达到 50% 中和的稀释度代表中和滴度。

首先，将 50 微升含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 添加到白色 96 孔板的 B 至 H 行，第 1 至 12 列。

5 微升恢复期血清加入第 2 至 10 列 A 行的孔中，总体积为 100 微升 DMEM，其中含有 10% 的 FBS 和 1% 的青霉素-链霉素。将 5 微升阳性和阴性抗血清添加到孔 A11 和 A12 中作为对照。

从A行的孔中取出50微升溶液，并对其下方的所有孔进行两次连续稀释。对于每次稀释，使用多通道移液器通过上下移液来混合溶液 5-10 次，而不会产生气泡。

完成连续稀释后，从每根色谱柱的最后一个孔中丢弃最后 50 微升。

每分钟 500 转的速度离心板 1 分钟，以确保孔壁上没有液体残留。计算稀释 SARS-CoV-2 PV 所需的 DMEM 量，如文本手稿中所述。

稀释的PV溶液混合在移液器盆中，并将50微升等分到每个孔中，但孔A6至A12除外，它包含仅细胞对照。A1 至 A6 孔用作仅 PV 对照。

每分钟 500 转的速度离心板 1 分钟，以确保孔壁上没有病毒残留。然后，将板与 5% 的二氧化碳在 37 摄氏度下孵育 1 小时，以使血清与 SARS-CoV-2 糖蛋白结合。

接下来，准备一盘 HEK 293T/17 靶细胞，该靶细胞在 24 小时前用 ACE2 和 TMPRSS2 质粒转染。从板中取出培养基，并用 2 毫升 PBS 洗涤两次，将其添加到培养皿的一侧以避免细胞脱落。

丢弃PBS并在板中加入2毫升胰蛋白酶。将板放入培养箱中，直到细胞分离。

细胞分离后，向板中加入6毫升含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM以淬灭胰蛋白酶活性，并轻轻重悬细胞。

使用自动细胞计数器或通过计数腔室载玻片来计数细胞。向每个孔中加入 1 x 10^{等分 4} 个细胞，总体积为 50 微升，并将板在 37 摄氏度下与 5% 的二氧化碳孵育 48 至 72 小时。

孵育后，从所有孔中取出培养基，并加入 25 微升 PBS 和商业荧光素酶测定试剂的 1：1 混合物。使用带有微孔板光度计的商业荧光素酶测定系统读取板。

使用光度计生成的原始数据，计算 IC50 中和抗体滴度，如文本手稿中所述。