从小鼠模型中分离不变的自然杀伤T细胞

首先通过腹腔注射将一种合成糖脂注入小鼠体内。

抗原提呈细胞（APCs）内化糖脂并将其提呈 通过 非经典的MHC分子CD1d

抗原呈递细胞迁移至脾脏，并与不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）相互作用，诱导iNKT细胞的活化和增殖。

取出脾脏。通过机械法解离以制备单细胞悬液。

将细胞转移至离心管中。加入密度梯度介质，离心以分离淋巴细胞。

收集淋巴细胞。加入负载糖脂抗原并标记荧光染料的CD1d四聚体，使其与iNKT细胞相互作用。

去除未结合的四聚体。加入可与四聚体连接的荧光染料结合的磁性微珠。

去除未结合的磁珠，并将细胞悬液上样至磁性柱中。

在磁场作用下，与磁珠结合的iNKT细胞被保留在柱中，而其余细胞则流过。

将柱子从磁场中取出。加入洗脱缓冲液以洗脱iNKT细胞。

将剂量为每公斤体重0.1毫克的α-GalCer通过腹腔注射至正常的DBA/1小鼠体内。造模后3天，在麻醉后分离小鼠脾脏。将脾脏在200目筛网上剪碎并研磨，制备单细胞悬液。用PBS洗涤细胞悬液。在200 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。

用1毫升全血和组织稀释液重悬细胞。加入3毫升小鼠淋巴细胞分离液，然后在室温下以300 × g 离心20分钟。

为了纯化iNKT细胞，将10^7个细胞重悬于100微升4摄氏度的PBS中。加入10微升负载α-GalCer的CD1d四聚体-PE，避光于4摄氏度孵育15分钟。用PBS洗涤细胞两次，再将细胞重悬于80微升PBS中。加入20微升抗PE微珠，避光于4摄氏度孵育20分钟。用PBS洗涤两次，最后将细胞重悬于500微升PBS中。

将分选柱置于MACS分选仪的磁场中，并用500 µL PBS冲洗。将制备好的细胞悬液加入分选柱中，收集流穿液，并用PBS缓冲液冲洗三次。移除磁场，向分选柱中加入1 mL PBS缓冲液。快速以恒定压力推动推杆，使标记细胞进入收集管，从而获得纯化的iNKT细胞。使用自动细胞计数器进行计数。