0 次观看 • 3:35 分钟 • July 8th, 2025
首先通过腹腔注射将一种合成糖脂注入小鼠体内。
抗原提呈细胞(APCs)内化糖脂并将其提呈 通过 非经典的MHC分子CD1d
抗原呈递细胞迁移至脾脏,并与不变的自然杀伤T细胞(iNKT细胞)相互作用,诱导iNKT细胞的活化和增殖。
取出脾脏。通过机械法解离以制备单细胞悬液。
将细胞转移至离心管中。加入密度梯度介质,离心以分离淋巴细胞。
收集淋巴细胞。加入负载糖脂抗原并标记荧光染料的CD1d四聚体,使其与iNKT细胞相互作用。
去除未结合的四聚体。加入可与四聚体连接的荧光染料结合的磁性微珠。
去除未结合的磁珠,并将细胞悬液上样至磁性柱中。
在磁场作用下,与磁珠结合的iNKT细胞被保留在柱中,而其余细胞则流过。
将柱子从磁场中取出。加入洗脱缓冲液以洗脱iNKT细胞。
将剂量为每公斤体重0.1毫克的α-GalCer通过腹腔注射至正常的DBA/1小鼠体内。造模后3天,在麻醉后分离小鼠脾脏。将脾脏在200目筛网上剪碎并研磨,制备单细胞悬液。用PBS洗涤细胞悬液。在200 × g 条件下离心5分钟,弃去上清液。
用1毫升全血和组织稀释液重悬细胞。加入3毫升小鼠淋巴细胞分离液,然后在室温下以300 × g 离心20分钟。
为了纯化iNKT细胞,将10^7个细胞重悬于100微升4摄氏度的PBS中。加入10微升负载α-GalCer的CD1d四聚体-PE,避光于4摄氏度孵育15分钟。用PBS洗涤细胞两次,再将细胞重悬于80微升PBS中。加入20微升抗PE微珠,避光于4摄氏度孵育20分钟。用PBS洗涤两次,最后将细胞重悬于500微升PBS中。
将分选柱置于MACS分选仪的磁场中,并用500 µL PBS冲洗。将制备好的细胞悬液加入分选柱中,收集流穿液,并用PBS缓冲液冲洗三次。移除磁场,向分选柱中加入1 mL PBS缓冲液。快速以恒定压力推动推杆,使标记细胞进入收集管,从而获得纯化的iNKT细胞。使用自动细胞计数器进行计数。
本文介绍了一种从小鼠脾脏组织中分离不变的自然杀伤T细胞(iNKT)的方法。该过程涉及使用合成糖脂和特异性标记技术,以纯化iNKT细胞用于进一步研究。
从小鼠模型中可靠地分离不变的自然杀伤T细胞(iNKT细胞)可实现对免疫细胞功能的精确分析,并支持以免疫学为重点的发现项目的机制性风险评估。该能力对于靶点验证以及建立可指导转化研究的稳健的临床前模型至关重要。高纯度的iNKT细胞制备物有助于可重复的下游检测,从而提高对免疫调节策略的预测可信度。
该iNKT细胞分离方案适用于从早期发现到临床前研究的连续阶段,可支持以假设为导向的研究以及免疫调节项目的检测开发。
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最后更新:22 八月 2026