一种用于制备嵌合抗原受体T细胞的离体技术

取原代T细胞，与连接有抗体的磁珠混合，在添加白细胞介素-2的培养基中孵育。

抗体结合T细胞受体复合物中的CD3以及共刺激受体CD28，同时白细胞介素-2与其同源受体结合，从而引起T细胞的活化与增殖。

引入编码嵌合抗原受体（CAR）的转基因RNA的慢病毒载体，并进行孵育。

病毒载体与细胞膜融合后，病毒RNA逆转录为DNA，并整合到宿主基因组中。

经转导的T细胞表达表面结合的CARs。

在规定的时间间隔收获细胞。

进行冷冻保存时，取一份细胞样品，通过移液吹打使结合的磁珠解离，然后进行磁力分离。

离心细胞并将其重悬于冻存液中。

将细胞冷冻并储存在低温环境中。

为评估CAR表达，取另一份细胞等分试样，离心沉淀细胞，并将其重悬于缓冲液中。

加入针对CAR的荧光标记抗体，并通过流式细胞术检测CAR的表达。

通过将新鲜或冻存的原代人T细胞与抗CD3/CD28磁珠按每3个磁珠对应1个T细胞的比例混合，加入培养板孔中以激活T细胞。在添加了正常人AB型血清、L-谷氨酰胺、HEPES和IL-2的X-VIVO 15培养基中培养T细胞。

扩增期间，以每毫升100万个T细胞的浓度激活T细胞，并在37摄氏度、20%氧气、5%二氧化碳和95%湿度条件下培养。经一夜刺激后，将慢病毒上清液加入已激活的T细胞中。计算所需上清液体积，以实现3至5之间的感染复数。继续在相同条件下培养细胞。

第3天，收集用于冷冻保存的细胞代表性等分试样。在冷冻保存前，通过轻柔吹打和磁力分离去除磁珠。制备含有0.5% DMSO的PBS冷冻保存液，并于4摄氏度保存，待用时取出。

接下来，将T细胞在300 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，加入5毫升PBS。再次在300 × g 条件下离心5分钟，并弃去PBS。将沉淀重悬于1毫升预冷的冷冻保存液中。将T细胞置于预冷的冻存容器中，于-80摄氏度保存48小时。

此后，将冻存的细胞转移至液氮中。用 5 毫升 PBS 将剩余的 T 细胞洗涤一次，以去除任何残留的载体。在 300 × g 下离心 5 分钟，然后弃去 PBS，并将细胞沉淀重悬于 T 细胞培养基中，细胞浓度为每毫升 500,000 个细胞。

将T细胞分为两组培养物，分别用于第5天和第9天的实验。使用计数微球、抗人CD4和CD8单克隆抗体以及活率染料，通过流式细胞术对T细胞进行计数。每隔一天更换一次培养基，以维持细胞浓度在每毫升50万个细胞。

第5天，按照此前所述方法对第5天的培养物进行计数并冷冻保存。第7天，用PBS洗涤500,000个细胞，并将其重悬于100 µL荧光激活细胞分选缓冲液中。随后通过流式细胞术，使用荧光标记的抗CAR19独特型抗体对CAR表面蛋白表达进行免疫染色检测。第9天，按照此前所述方法对第9天的培养物进行计数并冷冻保存。