使用修饰mRNA转染原代巨噬细胞

从含有以下成分的试管开始 体外 编码绿色荧光蛋白的转录mRNA。

mRNA 包含修饰的核苷酸，即5-甲基胞苷三磷酸和假尿苷三磷酸，可防止免疫反应并增强mRNA的稳定性。

mRNA 的 5' 端被去磷酸化，从而阻止巨噬细胞上的模式识别受体对其识别。

将阳离子脂质转染试剂加入 mRNA 中，通过静电相互作用促进 mRNA 的包封，形成复合物。

将脂质-mRNA复合物加入含有贴壁的小鼠原代巨噬细胞的多孔板中，并轻轻振荡以确保均匀混合。

巨噬细胞将含有mRNA的复合物内吞进入内体。随后，该复合物与内体膜融合，将mRNA释放到细胞质中。

3'端的poly-A尾可稳定mRNA，使其能够进行蛋白质合成，从而产生绿色荧光蛋白。

在荧光显微镜下，巨噬细胞内的绿色荧光表明已成功转染修饰的 mRNA。

通过向反应管中加入预先计算好的mRNA转染缓冲液体积（减去mRNA转染试剂和mRNA的体积），为转染做好准备。将mRNA储备液解冻，并通过轻柔翻转管子使其充分混匀。随后，向反应管中加入预先计算好的mRNA体积。

涡旋并离心反应混合物和mRNA转染试剂，然后将适量的mRNA转染试剂加入反应混合物管中。涡旋混匀该管，短暂离心，随后在室温下孵育15分钟。与此同时，将巨噬细胞的培养基更换为新鲜的预温培养基。

转染混合物孵育完成后，将混合物逐滴加入含有巨噬细胞的孔板中，加样时应从孔的外周向中心呈环形滴加。为确保转染混合物均匀分布，轻轻前后左右摇动孔板。

然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育培养板至少6小时。孵育结束后，通过荧光显微镜、流式细胞术或免疫印迹分析转染效率。

该实验步骤中最关键的部分是确保转染混合物的均匀分布，从而使所有巨噬细胞接触到相同剂量的 mRNA。