近红外光免疫疗法用于混合三维培养物中的靶向细胞清除

取一培养物，其中含有悬滴混合类球体，这些类球体为异质性细胞聚集体，包含表达生长因子受体及一种荧光蛋白的靶细胞，以及表达另一种颜色荧光蛋白的非靶细胞。

更换为含有靶细胞特异性单克隆抗体和光吸收染料的抗体-光吸收剂偶联物的培养基。

孵育以促进抗体与靶细胞受体的结合。

用培养基洗涤类球体以去除未结合的偶联物，然后将其转移至含培养基的玻璃底培养皿中进行光照照射。

将类球体暴露于近红外光下进行光免疫治疗，触发靶细胞上光吸收剂染料的光化学反应，导致细胞膜迅速受损并引起细胞死亡。

该过程可消除靶细胞，同时不损伤非靶细胞。

将类球体转移至新的悬滴板中。加入培养基并孵育以促进类球体生长。

在荧光显微镜下，靶细胞荧光的缺失表明细胞被有效清除，而非靶细胞荧光的存在则证实了光免疫治疗的选择性。

为制备混合的三维细胞培养，向96孔悬滴培养板的板储液区加入1毫升无菌水。然后，在适当的细胞培养基中，以感兴趣的细胞类型的不同比例进行接种，每孔培养基体积为50微升，至少接种5000个细胞，在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中培养5至7天。

每两天更换一次培养基，每天使用倒置明场显微镜在10至40倍放大倍数下观察类球体的形态和大小。当类球体直径达到400至600微米时，将悬滴板中的培养基更换为含有抗体-光吸收剂偶联物的培养基，然后将培养板放回培养箱中孵育六小时。

孵育结束后，用新鲜的无酚红培养基将类球体洗涤两次。然后，使用剪去末端的200微升枪头，将类球体逐个转移至含有玻璃底的50毫米培养皿中，每个培养皿中预先加入100微升新鲜的无酚红培养基。使用倒置显微镜观察类球体形态的变化。

为类球体进行照射时，将发光二极管置于距玻璃底培养皿不超过5英寸的位置，并使用光功率计确认发射波长为670至710纳米，能量密度为每平方厘米2焦耳。近红外光免疫治疗后，将类球体转移至新的悬滴培养板中，每孔加入50微升新鲜培养基，在细胞培养孵箱中培养1天。

然后，使用另一支末端切去的200微升移液枪头，轻柔地将类球体转移至新的玻璃底培养皿中，皿内含有100微升酚红-free培养基，随后在荧光显微镜下评估光学报告基因的表达。最后，通过向培养基中加入碘化丙啶或通过细胞质GFP荧光的消失来检测死亡细胞。