基于siRNA的单纯疱疹病毒感染未成熟树突状细胞中自噬的抑制

取两个电穿孔小室。其中一个小室含有小干扰RNA（siRNA），旨在抑制自噬诱导蛋白FIP200的产生。

第二个比色皿中含有作为对照的乱序siRNA，不会抑制FIP200的产生。

加入未成熟的树突状细胞（iDCs）；通过电穿孔使siRNA进入细胞，然后接种细胞。

内化的siRNA会结合到RNA诱导的沉默复合体上。

与FIP200特异性siRNA形成的复合物可切割其靶mRNA，从而抑制FIP200的生成，而经对照siRNA处理的iDCs则可产生FIP200。

收集细胞并加入单纯疱疹病毒。病毒包膜与细胞膜融合后，释放的DNA进入细胞核，导致病毒蛋白和核衣壳的产生。

病毒蛋白会破坏核纤层蛋白。FIP200 形成一种复合物，可触发信号级联反应，诱导受损的核纤层蛋白发生自噬，使其被靶向降解，从而促进病毒核衣壳逃逸至细胞质中。

由siRNA介导的FIP200生成抑制作用可限制核纤层蛋白的自噬，从而阻止核衣壳的释放。

细胞已准备好用于评估siRNA诱导的自噬抑制。

接种后第3.5天，将1200万个iDC细胞转移至一个50毫升离心管中。以300 × g离心 g 5 分钟后弃去上清液。同时进行流式细胞术分析以监测成熟状态。

用 5 毫升不含酚红的 OptiMEM 轻柔洗涤 iDCs，然后在 300 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 200 微升 OptiMEM 中，并调整细胞浓度至每 100 微升含 600 万个细胞。

向4毫米电极比色杯中加入75皮摩尔的FIP200特异性siRNA或乱序siRNA，并将100微升细胞悬液转移至相应的比色杯中。使用电穿孔仪直接对iDCs进行电脉冲处理。

电穿孔后，将iDCs转移至六孔板中，加入新鲜预热的DC培养基，使细胞终浓度为每毫升100万个细胞，并将六孔板放入培养箱中。48小时后，显微镜下观察电穿孔后的iDCs形态，然后用细胞刮收集细胞，并将其转移至15毫升离心管中。

用含有0.01% EDTA的1毫升PBS洗涤各孔，并将溶液转移至相应的试管中。然后，按照论文中所述方法，对每种siRNA条件下的细胞进行分装。

使用 500,000 个细胞评估成熟状态和细胞活力；使用 100 万个细胞进行蛋白质印迹分析，以验证 200 种特异性敲低效率；其余细胞用于 HSV-1 感染实验。