结核分枝杆菌综合肉汤稀释药敏试验微孔板格式为一线和二线药物

可用于治疗结核分枝杆菌的药物相对较少，因此对任何药物的耐药性都是一个问题。本视频文章介绍了同时测试结核分枝杆菌对 12 种不同微生物药物的抗生素耐药性的程序。因此，快速检测结核分枝杆菌抗菌素耐药性的能力对于控制耐药菌株的增加非常重要 这里 测试抗生素敏感性。

结核分枝杆菌首先在固体或肉汤培养基（一种细菌悬浮液）上生长。制备接种物并加入含有不同浓度的 12 种药物的微量滴定板中，包括孵育后的一线和二线药物。每个孔中的生长程度是使用镜盒或半自动读板器手动确定的。

结果数据表明每种测试药物的最低抑制浓度，并显示测试的结核病菌株对哪些抗生素具有耐药性。这些结果有助于选择合适的药物治疗结核病。大家好，我叫 Nancy Ek，是明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所菌类细菌学实验室的主任。

今天，我们将介绍一种对结核分枝杆菌进行抗生素敏感性检测的方法。与宏观肉汤稀释等现有方法相比，该技术的主要优点是确定每种药物的 MIC，并同时测试 12 种抗生素。演示该程序的是 Kurt Jude，他是我实验室的质量专家，在实验室工作台上工作。

通过标记血琼脂板、三个 Middlebrooks 7 H 10 板、一个盐水补间玻璃珠管和一个微量滴定板来准备此程序，并标明患者姓名和标本识别号。此外，将血琼脂和七个 H 10 板标记为纯度。检查：将这 7 个 H 10 板中的一个标记为 1 比 1 菌落计数，将另一个标记为 1 比 50 菌落计数。

然后将托盘放入通道中。接下来，穿上结实的前袍、头套手套、鞋套和呼吸器，准备在三级生物安全 BSL 三设施中工作。在这里，使用了 pappa 呼吸器。

然后从传递中检索托盘。接下来，在 BSL 三个设施中，对生物安全柜的表面进行消毒。然后将蘸有消毒剂的纸巾放在通风橱内，距离纸巾旁边的通风面板约 6 英寸。

放置接种环、移液器和吸头、适当的废物处理容器、nephi、TER 和涡旋。准备好罩子后，将生物体放在纸巾上，并放在带有 McFarland 0.5 标准 A 7 H 9 肉汤的架子上，该肉汤带有 OADC 和盐水珠管。此设置是从固体、中等完成。

从患者标本的固体培养基培养物中制备接种物。使用无菌环刮擦菌落并将它们转移到盐水补间玻璃珠管中。涡旋悬浮液 30 到 60 秒。

目视检查样品，将其与 McFarland 标准进行比较。转账金额应等于或大于标准。如果没有，请添加更多的细菌样品并涡旋。再。

一旦 McFarland 标准匹配，让接种物沉淀 15 分钟，以允许较大的细菌团块沉淀。接下来，使用 nefi TER 测量悬浮细菌的密度为零。尼腓特。

首先将空白盐水珠补间管放入 Nephi ter。按下校准按钮将仪器归零，然后将 McFarland 0.5 标准品放入 Nephi ter 中，再次按下校准按钮。校准仪器后，取出 McFarland 标准品并插入接种物。

接种物读数应等于 McFarland 标准读数。如果读数太低，请取出试管并从板中转移更多细菌。然后涡旋并再次读取样品。

如果读数太高，则向管涡旋中加入盐水补间。然后再次读取样本。根据需要继续调整接种物，直到细菌浓度与 McFarland 标准匹配。

接下来，使用 200 微升移液器和长气溶胶移液器吸头从试管的顶部三分之一处去除 100 微升接种物。为避免任何沉淀到底部接种的团块，Middlebrook 7 H 9 肉汤将接种的肉汤缓慢涡旋 20 秒以接种接种物首先从制造商的包装中取出微量滴定板。如果干燥剂是蓝色的或铝箔包装损坏，请勿使用。

该板已包含每个孔中要测试的 12 种抗菌剂，包括最有效或一线药物和二线药物。小心地将 7 H 9 肉汤接种物倒入 trth 中，注意不要产生气溶胶。然后如图所示，将微量滴定板的标签朝外放置，并使用 12 通道移液器向每个孔中加入 100 微升接种物。

接下来，准备用于进行菌落计数的板。首先，通过将 1 微升样品环从阳性对照孔转移到标记为一对一的 7 个 H 10 板中，制备未稀释的板。然后使用环在板上划线，如图所示。

接下来，要制备 1 比 50 的稀释液，从阳性对照孔中转移一个 1 微升的定量环，并将其旋转到带有 50 微升水条纹的试管中。在板上标有 1 到 50 的 1 微升这种稀释液。通过将 50 微升接种物从 trth 移液到适当标记的血琼脂和 7 个 H 10 板上并划线进行分离，接种纯度板。

然后将另一个 trth 堆放在接种的 trth 上，轻轻地将它们放入丢弃容器中。在微量滴定板上放置粘性密封件。然后使用白色背衬，用力按压每个孔以确保足够的天花板，确保没有折痕。

用蘸有结核杀虫剂消毒剂的纸巾擦拭微量滴定板，对微量滴定板进行消毒。然后将微量滴定板放入塑料袋中，用热封封住。最后，用结核杀虫剂擦拭所有材料，包括 nephi、lter 涡流、板和试管。

在这里，在经过足够的时间后使用 pro spray，以确保消毒。pro spray 15 分钟。用透明胶带将板贴上胶带，放入塑料袋中，将密封的耗材从生物安全柜中取出并放入通道中。

此时，将废弃的红色袋子封闭并用扭结带密封，取下长袍、短靴和手套。前往前厅洗手后，取下呼吸器消毒并存放，再次洗手后，穿上新长袍离开 BSL 三套房。接下来，对丢弃容器进行高压灭菌。

在此之后，在 BSL 两个实验室中，将微量滴定板和七个 H 10 和血液螺旋板右侧朝上在 35 至 37 摄氏度的培养箱中与 5% 至 10%CO 2 孵育。这是可以接受的，因为板密封良好且装在塑料袋中，结核分枝杆菌的生成时间约为 12 至 24 小时，因此至少需要一周的时间才能将生长看作是在对照底部形成细胞沉淀。好吧，在第 10 天，通过将密封的 ST 微量滴定刀片放在镜盒的平台上来执行手动镜子读取。

使用台灯来帮助可视化生长调整，以根据需要获得最佳对比度。通过照镜子检查生长控制孔，在这种情况下，H 11 和 H 12。如果有生长，井会显得浑浊或似乎有沉积物，如图所示。

如果没有本例所示的生长，则井看起来是透明的。在这种情况下，将板放回培养箱中并继续孵育长达 21 天。对于每个条件，将生长与对照进行比较。

那么，对于每个药物记录，第一个没有增长的稀释液。这是药物使用自动读板器（例如视觉）检查结果的最小抑制浓度或 MIC，首先打开 St 板软件 Myco TB 并将密封板记录到位，条形码朝外。如此处所示，生长在计算机屏幕上显示为浑浊或孔底部的细胞沉积。

首先，检查生长控制。如故。如果这对生长不利，请将板放回培养箱中最多 21 天。

如果这是积极的，则通过触摸第一个井来记录结果，该井不会在屏幕上显示每种药物的生长。在某些情况下，细菌、沉积物或药物会沉淀到井底。这种现象称为拖尾，由具有相同大小颗粒的几个井表示，实际上并不被认为是正生长。

接下来，检查 7 个 H 10 和血琼脂板以确定细菌浓度并评估纯度。血琼脂平板在 48 小时后应无生长。血琼脂平板上的生长表明受到快速生长的细菌的污染。

如果有生长，则必须重复微量滴定测试。7 个 H 10 纯度板应生长一个生物体。EM 型 结核病应呈浅黄色、有色、起皱和粗糙 如果受到污染，则需要从纯培养物中重复微量滴定测试。

为了评估细菌浓度，请对 7 个 H 10 平板上的菌落进行计数。然后使用随附书面文件中的表格计算菌落计数。结核分枝杆菌是从患者标本中生长的，并按照此处所示图版中的视频中所述评估抗生素耐药性，12 种不同的药物浓度递增，最高浓度在顶部，最低浓度在底部。

药物的最小抑菌浓度或 MIC 由未显示任何生长的药物的最低浓度表示，并在此处显示的图像中使用临床和实验室标准协会建立的标准化断点圈出。此处显示的数据表明，这种结核病菌株将对 Isid 和 Rifampin 产生耐药性。在体外，在其他几种药物（包括 oin、莫西沙星、链霉素和利福布汀）中观察到的高 MIC 表明 EM 结核菌株对这些药物的耐药性。

在结核病治疗方面经验丰富的传染病专家应使用 MIC 结果来制定个体化治疗计划：掌握此技术后，大约需要 40 分钟来设置一个分离株。在尝试此程序时，重要的是要记住这是一种呼吸道病原体，一旦您点生成气溶胶，观看此视频后，您应该对如何设置结核分枝杆菌、使用微量肉汤稀释法进行抗菌药物敏感性测试有很好的了解。不要忘记，与结核分枝杆菌打交道可能非常危险，因此应始终在需要的地方采取预防措施，例如呼吸保护。