0 次观看 • 4:42 分钟 • July 8th, 2025
取与初级脾细胞混合的逆转录病毒载体。
这些载体包含编码嵌合抗原受体（CAR）的转基因RNA，该受体可靶向肿瘤特异性抗原。
培养基中的细胞因子白介素-2可选择性促进T细胞增殖，而其他细胞最终会死亡。
将混合物转移至包被有重组纤连蛋白片段的微孔板中。
离心以促进纤连蛋白片段与载体和T细胞结合，介导病毒与宿主细胞的相互作用，并进行孵育。
当载体的包膜与细胞膜融合后，病毒酶将释放出的RNA逆转录为DNA，并将其整合到宿主基因组中。
经转导的T细胞表达表面结合的嵌合抗原受体（CAR），该受体由靶向肿瘤特异性抗原的胞外抗体可变区片段以及可对 antigen 产生应答的胞内信号传导区域组成。
在将细胞转移至离心管之前，先重悬细胞。
离心以弃去含有未内化病毒的上清液，并将细胞重悬于缓冲液中，用于后续检测。
脾切除术后次日，配制含有每毫升25微克重组人纤连蛋白片段（RHFF）的磷酸盐缓冲液（PBS），并通过向每个孔中加入0.5毫升该溶液，包被未经组织培养处理的24孔板。次日，移除各孔中的溶液，并向每孔加入1毫升含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液。
室温孵育30分钟，然后将培养板倒置以彻底去除BSA，再加入2毫升PBS进行洗涤。从HEK293T细胞收集病毒上清液后，加入新鲜TCM，终体积（毫升）等于RHFF包被孔的数量加上额外的3毫升。
从培养箱中取出培养的脾细胞，通过在每个孔中轻轻吹打两到三次重新悬浮细胞。将细胞悬液转移至50毫升锥形管中。接着，将脾细胞重悬于病毒上清液中，调整细胞密度至每毫升1 × 106个细胞。
然后，向 RHFF 包被板的每孔中加入 1 毫升脾细胞悬液。现在，将板在 32 摄氏度下以 770 g 离心 90 分钟，加速度设为 4，刹车设为 0。离心期间，用 TCM 制备每毫升含 50 国际单位的重组人 IL-2。
离心后，向每孔中加入1毫升培养基，过夜培养。若T细胞融合度超过80%，则在每孔中轻轻吹打2至3次，使细胞重悬，然后将每孔中的1毫升细胞悬液转移至新的24孔组织培养处理板的孔中。
向每个孔中加入1毫升新鲜TCM培养基，其中含50国际单位/毫升的IL-2。如果细胞融合度未达到80%以上，则更换一半培养基：缓慢吸去每孔上层1毫升培养基，然后加入1毫升含50国际单位/毫升重组人IL-2的新鲜TCM培养基。
轻轻吹打每孔细胞3次，重悬CAR T细胞，然后转移至250毫升离心管中。以300 g离心10分钟。随后彻底吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。使用PBS洗涤细胞，计数后再进行第二次洗涤。典型的CAR T细胞产量约为每孔1 × 106个细胞。