0 次观看 • 2:55 分钟 • July 8th, 2025
从T细胞悬液开始，用携带嵌合抗原受体（CAR）基因的CAR慢病毒和CRISPR慢病毒进行处理。
CRISPR 慢病毒含有编码向导 RNA 和 Cas9 核酸酶的基因，以及一个抗生素抗性基因。
CAR 和 CRISPR 慢病毒均与 T 细胞相互作用并释放其 RNA。
这些RNA被逆转录并转化为相应的DNA，随后整合到T细胞的DNA中。
这使得CAR蛋白、向导RNA和Cas9蛋白的合成成为可能。
向导RNA与Cas9形成复合物，该复合物可特异性识别并结合T细胞DNA上的靶基因。
与此同时，Cas9 切割 DNA，产生双链断裂。
此断裂被修复 通过 非同源末端连接，一种易错的修复机制，可导致靶基因的修饰。
这将生成带有嵌合抗原受体的基因修饰T细胞。
使用抗生素处理细胞，以清除未修饰的T细胞，并选择性分离基因修饰的CAR T细胞。
为了破坏粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，使用文中所述的向导RNA。将转染试剂在室温下孵育30分钟。孵育结束后，将其加入已达到70%至90%融合度的293T细胞中，并将转染后的细胞在37摄氏度、5% CO2条件下培养以产生慢病毒。
在24小时和48小时时，收集并用超速离心法在50毫升超速离心管中浓缩含病毒的上清液，随后于-80摄氏度冷冻保存以备后续使用。然后，在第1天，轻柔重悬T细胞以打散玫瑰花环结构。
在符合BSL-2 plus标准的认证实验室中，为生成CAR T细胞，将CAR19慢病毒和靶向GM-CSF的CRISPR慢病毒加入已激活的T细胞中。在第3天和第5天，对成功转导并携带嘌呤霉素抗性的慢病毒CRISPR编辑T细胞，使用嘌呤霉素二盐酸盐处理，浓度为每毫升含1微克嘌呤霉素。