一种用于T细胞基因编辑的CRISPR-Cas9技术

取悬浮在适合电穿孔的培养基中的T细胞，电穿孔是一种通过电脉冲在细胞膜上形成临时孔隙的过程。

加入含有 Cas9 蛋白和单链向导 RNA（sgRNA）的复合物。sgRNA 是一种小 RNA，可将分子剪刀 Cas9 引导至 DNA 上特定位置进行切割。

添加短的单链DNA分子，以协助将Cas9-sgRNA复合物转运进入细胞。

将该混合物转移至比色皿中，并通过施加短暂的电脉冲启动电穿孔。

该过程可使复合物进入细胞。

sgRNA 会结合到 T 细胞 DNA 中的靶位点，使 Cas9 能够编辑 DNA，从而在两条链中均产生断裂。

这种破坏会将修复蛋白招募到该位点。

修复蛋白随后重新连接末端，使该基因失去功能。

将基因编辑的T细胞在适当的培养基中孵育，以进行后续实验分析。

通过将10微克Cas9核酸酶与5微克单链向导RNA在室温下孵育10分钟，制备核糖核蛋白（RNP）复合物。设置不含单链向导RNA的模拟对照组。将重悬的T细胞与RNP复合物混合，并加入4.2微升4微摩尔的电转增强剂。充分混匀后，转移至电转杯中。

使用脉冲程序 EH-1-11 对细胞进行电镀。然后将细胞以每毫升500万个的密度悬浮于R-10培养基中，添加5纳克/毫升人IL-7和人IL-15，在12孔板中于30°C孵育48小时。孵育结束后，进行T细胞活化与扩增。