生成多价展示外膜囊泡疫苗

取含有与聚合物结合的靶质粒的转染多聚复合物。这些质粒编码一种病毒抗原，该抗原融合了一个肽标签和一个亲和标签。

将多聚复合物与哺乳动物细胞共同孵育，细胞会将多聚复合物内吞至内体中。

该聚合物可诱导囊泡破裂。释放的质粒表达病毒抗原，并被分泌至细胞外。

收集含有抗原和杂质的上清液。加入低浓度的竞争剂。

将其上样到亲和层析柱上。

亲和标签与柱树脂结合，使抗原固定，而竞争剂则减少非特异性结合。

以低浓度流经竞争性试剂，去除弱结合的污染物。

用逐渐增加的竞争剂浓度进行洗涤，以置换强结合的抗原并将其洗脱。

引入带有表面结合捕获蛋白的细菌外膜囊泡（OMVs）并进行孵育。

抗原肽标签与捕获蛋白结合，形成具有多价抗原展示的OMV疫苗。

进行OMV SpyCatcher 纯化。首先将细菌溶液离心。用0.22微米膜滤器过滤上清液，然后使用中空纤维柱进行浓缩。将浓缩液通过0.22微米膜滤器再次过滤，随后在4摄氏度下以150,000 × g 离心2小时，使用超速离心机离心后用移液器弃去上清液。用PBS重悬沉淀物，并在-80摄氏度下保存。

进行RBD-SpyTag转染时，首先选择合适的真核表达系统，在复苏后于37摄氏度、130转/分钟条件下过夜培养细胞。取20微升HEK293F细胞溶液加入自动细胞计数仪中，记录细胞数量。将细胞浓度调整至每毫升1×10⁶个细胞，随后在37摄氏度、130转/分钟条件下继续培养4小时。

将RBD-SpyTag质粒通过0.22微米膜过滤器过滤，并向细胞培养基中加入300微克质粒，直至终体积为10毫升。振荡10秒。将PEI置于水浴中加热至65摄氏度。将0.7毫升PEI与9.3毫升细胞培养基混合，并间歇振荡10秒。

将质粒溶液加入PEI溶液中。间歇振荡混合物10秒，于37摄氏度孵育15分钟。将混合物加入280毫升细胞培养基中，于37摄氏度、130转/分钟条件下培养5天。

接下来，进行RBD-SpyTag纯化。首先以6,000 × g离心细胞 g 在25摄氏度下孵育20分钟，用移液器收集上清液。用2毫升镍-NTA琼脂糖构建层析柱，并用PBS洗涤三次。

向细胞上清液中加入咪唑，使其终浓度为 20 毫摩尔，并上样至层析柱。用含有 20 毫摩尔咪唑的 PBS 缓冲液洗涤，体积为 3 个柱体积，并收集洗涤组分。使用含有从低到高浓度咪唑的 PBS 缓冲液进行梯度洗脱，体积为 3 个柱体积。每个浓度洗脱两次。

采用BCA法测定蛋白质浓度时，将标准BSA蛋白溶液从2毫克/毫升至0.0625毫克/毫升进行系列稀释。将纯化的OMV SpyCatcher 和 RBD-SpyTag稀释10倍。随后，按50:1的比例混合BCA工作液A与B。加入稀释后的蛋白质溶液，并与BCA工作液混匀。在37°C孵育30分钟。测定各孔在562纳米处的吸光度，并根据标准曲线计算蛋白质浓度。

为进行OMV SpyCatcher 与RBD-SpyTag的生物偶联，将OMV SpyCatcher 与RBD-SpyTag在PBS中按40:1的比例混合，在4摄氏度、每分钟15转的条件下垂直旋转过夜以充分混匀。使用PBS溶液对OMV RBD进行纯化，纯化步骤参照OMV SpyCatcher 的纯化方法进行。