生成多价显示外膜囊泡疫苗

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取含有与

聚合物结合的靶质粒的转染多链体。质粒编码与肽标签和亲和标签融合的病毒抗原。

多链体与哺乳动物细胞一起孵育,哺乳动物细胞将多链体内化在内体内。

聚合物诱导囊泡破裂。释放的质粒表达病毒抗原,病毒抗原在细胞外分泌。

收获含有抗原和污染物的上清液。添加低浓度的竞争剂。

将其加载到亲和色谱柱上。

亲和标签与柱树脂结合,固定抗原,而竞争剂则减少非特异性结合。

低浓度流动竞争剂,去除弱结合污染物。

用增加竞争试剂浓度洗涤,以置换强结合抗原,洗脱它们。

引入具有表面结合捕获蛋白的细菌外膜囊泡或OMV并孵育。

抗原肽标签与捕获蛋白结合,形成具有多价抗原显示的 OMV 疫苗。

执行 OMV SpyCatcher 纯化。从离心细菌溶液开始。用 0.22 微米膜过滤器过滤上清液,然后使用中空纤维柱浓缩。通过0.22微米膜过滤器过滤浓缩物,然后使用超速离心机在4摄氏度下以150,000倍g离心两小时,并用移液器丢弃上清液。用PBS重悬沉淀并将其储存在-80摄氏度。

要进行RBD-SpyTag转染,首先选择合适的真核表达系统,并在恢复后在37摄氏度下以每分钟130转的速度培养细胞过夜。将 20 微升HEK293F的细胞溶液加入自动细胞计数仪中。记录单元格的数量。将浓度调整为每毫升10至第6个细胞的1倍,然后在37摄氏度下以每分钟130转的速度培养细胞4小时。

通过 0.22 微米膜过滤器过滤 RBD-SpyTag 质粒,并将 300 微克质粒加入细胞培养基中,直至最终体积为 10 毫升。摇晃 10 秒钟。在水浴中将 PEI 加热至 65 摄氏度。将 0.7 毫升 PEI 与 9.3 毫升细胞培养基混合,间歇摇动 10 秒钟。

将质粒溶液添加到PEI溶液中。间歇摇动混合物10秒钟,并在37摄氏度下孵育15分钟。将混合物加入280毫升细胞培养基中,并在37摄氏度下以每分钟130转的速度培养5天。

接下来,进行 RBD-SpyTag 纯化。首先在25摄氏度下以6,000倍g离心细胞20分钟。并使用移液器收集上清液。用 2 毫升镍-NTA 琼脂糖构建色谱柱,并用 PBS 洗涤 3 次。

咪唑加入细胞上清液中,使终浓度为20毫摩尔,并加载细胞上清液。加入3柱体积的含有20毫摩尔咪唑的PBS进行洗涤,并收集洗涤馏分。用含有低浓度至高浓度咪唑的三柱体积PBS梯度洗脱。每种浓度洗脱两次。

要通过BCA方法测定蛋白质浓度,请将标准BSA蛋白溶液从2至0.0625毫克/毫升连续稀释。将纯化后的 OMV SpyCatcher 和 RBD-SpyTag 稀释 10 倍。然后,以 50 比 1 的比例混合 BCA 工作溶液 A 和 B。加入稀释的蛋白质溶液并与 BCA 工作溶液混合。在37摄氏度下孵育30分钟。测量每个孔562纳米处的吸光度,并根据标准曲线计算蛋白质浓度。

要进行OMV SpyCatcher和RBD-SpyTag的生物偶联,请在PBS中的RBD-SpyTag中以40比1的比例混合OMV SpyCatcher。在 4 摄氏度下以每分钟 15 转的速度垂直旋转以混合混合物过夜。使用类似于 OMV SpyCatcher 纯化的程序,使用 PBS 溶液对 OMV RBD 进行纯化。

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Last updated: 18 July 2026