构建感染细菌病原体的绵羊离体创伤皮肤模型

在无抗生素培养基中取一块来自羔羊前额的预先灭菌皮肤活检组织。

该部分由外层表皮和其下方的真皮层组成。

移去培养基，并使用缓冲液洗涤切片。

在切口处做环形切割并去除表层。这会破坏屏障，在皮肤上形成创面床。

将受损的组织切片转移至含无抗生素培养基的多孔板中的可渗透膜插件上。

将致病菌悬液接种至伤口床并进行孵育。

孵育期间，创面床为细菌附着提供了组织表面，并提供支持细菌生长的营养物质。

这使得细菌能够在伤口床内增殖并扩散，从而建立感染。

为感染皮肤样本，准备新鲜的24孔板，每孔加入400 µL预热的无抗生素培养基，并使用无菌镊子放入24孔插入式培养小室。移除皮肤样本中的培养基，用500 µL无菌PBS洗涤样本，然后吸去洗涤液。

使用无菌镊子轻轻将样本固定在孔的底部。用直径4毫米的穿刺活检针穿过皮肤样本，深度约为1至2毫米，制作一个中央伤口瓣膜。然后，使用15号刀片手术刀和无菌带齿Allis组织镊子去除伤口瓣膜的表层组织。

所有样本接种损伤后，使用无菌镊子将其转移至24孔板插件中。在37摄氏度的湿润组织培养箱中孵育24小时之前，用移液器向伤口区域加入15微升细菌接种液。若需更长的孵育时间，则需移除培养基，每隔24小时更换一次新鲜培养基，并在相同条件下继续孵育培养板。