0 次观看 • 4:22 分钟 • July 8th, 2025
取一段 CRISPR RNA（crRNA）和一段反式激活 crRNA（tracrRNA）的混合物。
加热混合物后使其冷却，以促进tracrRNA与crRNA之间的碱基配对，形成向导RNA（gRNA）。
加入称为 Cas9 酶的分子剪刀，其与 gRNA 结合并形成复合物。
将 Cas9-gRNA 复合物加入悬浮于电穿孔溶液中的自然杀伤细胞（NK 细胞）中。
引入单链DNA分子，以协助Cas9-gRNA复合物的转运。
将混合物转移至比色皿中，进行电穿孔，使膜上形成临时孔隙，以便复合物进入细胞。
gRNA 与基因组中的靶位点结合，使 Cas9 能够切割 DNA。
修复蛋白在断裂位点结合并连接DNA，通常会导致碱基对的插入或缺失错误。这种修饰会破坏目标基因，使其失去功能。
将基因修饰的细胞转移至适当的培养基中，以进行后续分析。
电穿孔当天，为每种实验细胞条件准备一个T25培养瓶，加入8毫升新鲜培养基，并补充100 IU/毫升的IL-2，将培养瓶置于37摄氏度、5% CO2的湿化培养箱中。
在培养基平衡的同时，将每种条件下 3 至 4 × 106 个细胞加入 26 微升转导混合液中，置于锥形管内，通过离心收集细胞。随后，每次用 12 毫升无菌 PBS 洗涤细胞三次，每次洗涤均需去除细胞悬液中的全部 FBS。
在洗涤细胞的同时，将每种CRISPR RNA和示踪RNA重悬至200微摩尔的终浓度。每个样品中加入2.2微升的每种CRISPR RNA和一份200微摩尔体积的示踪RNA，混匀后于95摄氏度加热5分钟。随后让样品冷却至室温，并将CRISPR RNA-示踪RNA复合物保存于负20摄氏度，直至使用。
为了形成核糖核蛋白复合物，将Cas9核酸内切酶加入相应的CRISPR RNA - 示踪RNA复合物中，轻轻混匀30至60秒，然后在室温下孵育所得的Cas9核糖核蛋白复合物15至20分钟。
最后一次洗涤后，加入P3 4D-Nucleofector试剂盒中的全部电穿孔补充液体积，将每份细胞沉淀重悬于20 µL的P3原代4D-Nucleofector溶液中，注意避免产生气泡。
立即将每种核糖核蛋白复合物各 5 微升加入相应的细胞悬液中，并向 Cas9 核糖核蛋白复合物细胞混合物中加入 1 微升 100 微摩尔的 Cas9 电穿孔增强剂。将 26 微升 Cas9 核糖核蛋白细胞溶液转移至 Nucleocuvette Strip 的各个孔中，并轻轻敲击条带，确保样品覆盖每个孔的底部。
然后，启动4D-Nucleofector系统的EN-138程序。转导结束后，让细胞静置3分钟。随后，向每个电转杯中加入80 µL预平衡的培养基，并将样品轻柔地转移至37°C培养箱中，每种条件分别接种于一个培养瓶中。