生成用于疫苗的重组减毒流感病毒

从携带编码冷适应流感毒株某些病毒必需蛋白的cDNA的双向质粒开始。

引入一组新的双向质粒，这些质粒包含来自不同流感病毒株的血凝素和修饰后的神经氨酸酶cDNA。

向该混合物中加入转染试剂，并孵育以与质粒形成复合物。

将这些复合物转移至培养的人类类上皮细胞中，以实现质粒进入细胞。

具有两个反向启动子的双向质粒能够实现病毒蛋白及其相应RNA的表达。

将细胞在较低温度下孵育。

病毒蛋白和病毒RNA会自我组装，形成冷适应的重组流感病毒，其在较温暖条件下的复制能力降低。

使用唾液酸过表达的MDCK细胞和经过修饰的胰蛋白酶酶进行覆盖，以促进病毒与细胞的附着及进入细胞内。

在相同温度下孵育，以诱导病毒复制和新病毒的产生。

离心并收获用于疫苗制备的重组减毒活流感病毒。

首先，在6孔板的每个孔中接种一百万个293T细胞，加入含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。接着，为每孔准备100微升的质粒转染混合液。取每种质粒各1微克，用预热的Opti-MEM细胞培养基补至50微升。在另一管中，加入与待转染质粒总量相对应的Lipofectamine 2000体积的两倍量，并用Opti-MEM补至50微升。

在将转染混合物加入细胞之前，先在室温下静置30分钟。然后，向每孔中加入100微升转染混合物，并将培养板放入培养箱中孵育16小时。第二天，更换培养基为含0.3% BSA和1%青霉素-链霉素的DMEM。随后，将细胞置于33摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育5小时。

五小时后，在含有胰蛋白酶的DMEM培养基中加入一百万个允许流感病毒感染的MDCK细胞作为覆盖层。在33摄氏度的培养条件下共同培养2至3天，以生成并扩增病毒。随后，以260 ×g离心五分钟去除碎片，收集上清液。