生成用于疫苗的重组减毒活流感病毒

从携带编码适应寒冷的流感毒株的某些病毒必需蛋白的 cDNA 的双向质粒开始。

引入一组新的双向质粒，其中包含来自不同流感毒株的血凝素和修饰的神经氨酸酶 cDNA。

转染试剂引入该混合物中并孵育以与质粒形成复合物。

将这些复合物转移到培养的人上皮样细胞上，使质粒能够进入细胞。

具有两个方向相反的启动子的双向质粒能够产生病毒蛋白及其相应的 RNA。

较低温度下孵育细胞。

病毒蛋白和病毒RNA自组装形成适应寒冷的重组流感病毒，在温暖的条件下复制减少。

与唾液酸过表达的 MDCK 细胞和修饰的胰蛋白酶覆盖，允许病毒附着和进入细胞内。

在相同温度下孵育以诱导新病毒的复制和产生。

心并收获重组减毒活流感病毒，准备用于疫苗制备。

首先，在含有 10% 胎牛血清和 1% 笔链球菌的 DMEM 中接种 6 孔板的每个孔中接种 100 万个 293T 细胞。接下来，准备足够的质粒转染混合物，每孔 100 微升。将每个质粒混合一微克，并用预热的 Opti-MEM 细胞培养基填充管至 50 微升。在另一个试管中，加入两倍体积的lipofectamine 2000，对应于要转染的质粒总量，并用Opti-MEM将管加至50微升。

在将转染混合物添加到细胞中之前，让它在室温下静置30分钟。然后，向每个孔中加入 100 微升转染混合物，并将板移至培养箱中 16 小时。第二天，将培养基更换为含有 0.3% BSA 和 1% 笔链球菌的 DMEM。然后。将细胞移至 33 摄氏度，并加入 5% 的二氧化碳五小时。

五小时后，在补充胰蛋白酶的DMEM中加入100万个流感允许的MDCK细胞。在33摄氏度的孵育条件下将共培养物维持2至3天，以产生和扩增病毒。之后，使用5分钟的260克旋转清除碎屑，然后收集上清液。