从骨髓干细胞制备质膜囊泡

从骨髓干细胞培养开始。

加入胰蛋白酶-EDTA缓冲液，以解离细胞并分散细胞团块，形成单细胞悬液。

离心，然后移除上清液。用新鲜培养基重悬沉淀。

将悬液转移至注射器中，并连接至膜过滤装置。

推动活塞，弃去含有滤液的培养基。

取下滤器。用新鲜培养基填充注射器。重新连接滤器，并迅速推动推杆。

液体的压力将细胞推向滤膜孔隙。

这会形成一个球形的质膜小泡（PMV）。

这些囊泡含有被膜包围的细胞组分和细胞器。

在倒置相差显微镜下观察滤液，可见半透明的球形囊泡。

囊泡的尺寸与滤膜的孔径相匹配，证实了PMVs的生成。

为制备PMVs，首先将小鼠PMSCs在六孔板的一个孔中，使用完全DMEM培养基于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中进行培养。当细胞融合度达到90%时，用0.5毫升无钙PBS冲洗孔内，再加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞使其脱离。

在37摄氏度条件下孵育3分钟后，用手掌轻拍培养板数次以促进细胞解离，并加入1毫升培养基终止消化。将细胞转移至5毫升锥形管中进行离心，然后将沉淀重悬于4毫升新鲜培养基中。随后，将细胞分至新的六孔板的两个孔中，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养24小时。

第二天，通过胰蛋白酶消化法从一个孔中收集细胞（方法如前所述），离心收集后将沉淀重悬于0.5毫升新鲜培养基中。将细胞悬液加入1毫升胰岛素注射器中，并将注射器连接至滤器装置。迅速下压推杆，使细胞通过滤器，弃去挤出的培养基。然后，再次加入并推注0.5毫升额外培养基通过滤器（方法如前所述），收集第二次挤出的培养基。

取150微升收集的培养基接种到35毫米玻璃底培养皿中，静置约10分钟使囊泡沉降。然后，使用配备CCD相机的倒置相差显微镜，以20倍物镜确认PMVs的存在。