生成抗血管生成的肿瘤相关中性粒细胞

取一个包含肿瘤相关中性粒细胞（TANs）的小鼠黑色素瘤肿瘤。

肿瘤相关中性粒细胞（TANs）表现出烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）活性升高，可促进肿瘤内血管生成（即血管增殖），并促进肿瘤生长。

将组织切碎，并加入酶以降解组织基质，使细胞松散。

通过滤网过滤悬液，并离心以沉淀细胞。

加入裂解缓冲液以裂解红细胞，然后离心并弃去含有细胞碎片的上清液。

引入抗体以阻断细胞的 Fc 受体，从而避免非特异性免疫染色。

加入针对TANs表面标志物的荧光素标记抗体混合物以及用于区分死细胞的染料。

使用流式细胞术（FACS）分离荧光标记的活体肿瘤相关中性粒细胞（TANs），并将其转移至微孔板中。

向选定的孔中加入抑制NAMPT活性的抑制剂，并进行孵育。

利用这些细胞评估其促血管生成能力。与未处理的TANs相比，经抑制剂处理的TANs显示出血管生成减少。

为分离肿瘤相关性中性粒细胞，将每份收获的五个肿瘤分别放入无菌六孔板的各个孔中，并使用无菌剪刀将肿瘤剪切成2至3毫米大小的组织块。随后，在37摄氏度、5%二氧化碳及湿润条件下，用1毫升基于酶盘的胶原酶和DNase I溶液消化肿瘤碎片45分钟，每隔15分钟用10毫升注射器混匀样品一次。

孵育结束后，将细胞通过100微米滤网过滤至每孔一个15毫升离心管中，以去除未消化的纤维，并加入PBS至终体积为15毫升。通过离心收集解离的细胞，并每管加入1毫升裂解缓冲液以裂解红细胞。

混合后，将各管中的内容物合并至一个15毫升离心管中，加入11毫升完全4摄氏度培养基，反应2分钟后终止反应。离心后，将沉淀重悬于1毫升PBBS中，并在冰上加入3微升FC阻断抗体孵育15分钟，以封闭非特异性结合位点。

孵育结束后，在避光冰上用抗 CD11b 和 Ly6G 抗体以及其他感兴趣的抗体加上 DAPI 对细胞进行标记，孵育 30 分钟。标记结束后，用 14 毫升 PBS 洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于冰上，重悬浓度为每毫升新鲜完全培养基含 1 × 10⁷ 个细胞。

然后，根据标准分选方案，使用荧光激活细胞分选仪对CD11b阳性、Ly6G高表达、DAPI阴性的中性粒细胞进行分选，并在分选结束后通过流式细胞仪检测所分离中性粒细胞的纯度。对于 在 体外 肿瘤相关性中性粒细胞抑制：将分选后的中性粒细胞以每孔1.5 × 10⁵个细胞的密度接种至96孔U型底板的两个孔中，在其中一个孔中加入FK866至终浓度为100 nmol/L（溶于完全培养基），另一孔加入等体积的完全培养基作为对照。在细胞培养箱中孵育2小时后，用PBS洗涤细胞两次，将细胞沉淀重悬于适量浓度的PBS中，用于后续注射。