由诱导性多能干细胞生成单阳性CD8 T细胞

在明胶基质上、以基质细胞为饲养层培养诱导性多能干细胞。

饲养层模拟了天然的细胞外环境，引导干细胞分化为含有造血祖细胞的穹顶状类器官。

加入酶以解离共培养的细胞。

将细胞转移至新的明胶包被的培养皿中，以促进基质细胞的黏附。

在分化培养基中收集未贴壁的造血祖细胞。

将细胞接种至新鲜的饲养层上培养，以促进前体细胞分化为表达CD4和CD8受体的双阳性T细胞以及不表达这两种受体的双阴性T细胞。

将细胞转移至离心管中。加入携带CD4特异性抗体的磁珠，孵育，以特异性标记双阳性T细胞。

使用磁性分离器分离双阳性细胞，并将其培养在新鲜的饲养层上。

添加细胞因子和抗体混合物以刺激细胞，诱导CD4受体下调，并促进其分化为CD8单阳性细胞。

在与人诱导性多能干细胞共培养前一周，准备明胶包被的OP9-delta-1培养皿。向三个新的细胞培养皿中各加入4毫升0.1%明胶溶液，在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，吸除明胶溶液，每皿加入8毫升OP9培养基。将一皿汇合的OP9-delta-1细胞传代至三个明胶包被的培养皿中。

四天后，向每皿细胞中加入 10 毫升 OP9 培养基，使每皿培养基总体积达到 20 毫升。在细胞传代后第七至第八天，开始将人诱导性多能干细胞（iPSC）接种于 OP9-delta-1 汇合的培养皿中进行共培养。吸除汇合的人iPSC培养皿中的培养基，并加入 10 毫升 OP9 培养基。

使用一次性细胞传代工具切割并分离细胞克隆，将350至600团切割后的克隆转移至预先明胶包被的OP9-delta-1培养皿中，加入10毫升新鲜OP9培养基。通过左右及前后轻摇培养皿，确保克隆均匀分布。次日，吸除用过的培养基，更换为20毫升新鲜OP9培养基。

人iPSC细胞团块在OP9-delta-1细胞上共培养一天后，应呈现为小而圆的单层细胞集落。第5天时，吸出10毫升用过的培养基，并加入10毫升新鲜的OP9培养基。此时细胞集落将开始分化为原始中胚层，其特征是出现多层结构的深色中心。

在第9天重复此步骤，此时多层中心结构将发育成穹顶状。在第13天收获造血祖细胞，此时结构由一个深色的中央类器官及其周围分布的网状穹顶样区域组成。吸除培养基，用5毫升含钙镁的1×无酚红汉克平衡盐溶液（Hank's balanced salt solution with calcium and magnesium, HBSS）洗涤细胞一次。

洗涤后，向10毫升HBSS中加入250微升浓度为每毫升5,000单位的胶原酶-4。将混合液加入细胞中，在37°C下孵育45分钟。吸除HBSS-胶原酶混合液，用5毫升PBS洗涤细胞一次。PBS洗涤后，加入5毫升0.25%的胰蛋白酶-EDTA，于37°C孵育20分钟。

然后，加入4毫升OP9培养基，通过移液吹打使细胞层解离，制成单细胞悬液。将细胞悬液经100微米细胞筛过滤后转移至50毫升锥形管中，以300 × g离心 g 4摄氏度下离心5分钟。吸去上清液，将细胞重悬于10毫升OP9培养基中。

将细胞悬液接种至新的明胶包被的10厘米细胞培养皿中，在37摄氏度下孵育45分钟。随后，通过轻柔吹打收集未贴壁的细胞。将细胞悬液经滤网转移至50毫升锥形管中，按先前所述条件离心。然后吸除上清液，将细胞重悬于10毫升分化培养基中。

将细胞悬液接种至新的OP9-delta-1汇合培养皿中。根据文稿说明，在第16天进行细胞传代，此后每5至7天对非贴壁细胞进行一次传代。分化35天后，按照生产商说明书，利用CD4磁珠分离法富集CD4阳性细胞群体。

然后，用OP9培养基重悬细胞，并将1毫升细胞悬液接种至含有融合OP9-delta-1细胞的组织培养平底24孔板的每个孔中。每孔加入100国际单位人IL-2、5纳克人IL-7、500纳克抗人CD3抗体和2微克抗人CD28抗体，以刺激细胞。培养四至七天后，可收集细胞进行进一步分析。