斑马鱼神经干细胞原代神经球的生成与分化

从含有添加了生长因子的生长培养基的多孔板开始。

接种斑马鱼神经干细胞的单细胞悬液并进行培养。

最初，干细胞利用生长因子进行增殖。

去除碎片，并加入新鲜培养基，以促进细胞持续增殖并自发聚集形成悬浮的初级神经球。

接下来，将神经球转移至含有生长培养基的新培养孔中。

在相同条件下孵育，以诱导神经球逐步扩增。

用移液器反复吹打，将神经球机械解离成小细胞簇。

接下来，将它们转移至包被有细胞外基质的孔中，以促进其黏附。

用不含生长因子但含有胰岛素的分化培养基替换生长培养基。

缺乏生长因子并存在胰岛素的条件下，可促进细胞分化为胶质细胞和具有神经突起的神经元。

为准备神经球的生成，向24孔板的每孔中加入300微升新鲜的Z条件培养基。然后，向每孔加入200微升细胞悬液，使接种密度约为每微升500个细胞。随后，将培养板置于30°C、5%二氧化碳环境中孵育。

培养一天后，在显微镜下观察24孔板中的细胞。此阶段应观察到单细胞悬液。若发现任何碎片聚集在孔中央，可用移液器吸出约100微升培养基，并加入100微升新鲜Z条件培养基以补充液体。待所有碎片清除后，将培养板置于前述条件下继续孵育。

再培养一天后，从单个孔中转移 250 微升细胞悬液至一个新的空孔中。对全部 24 个孔重复此步骤。然后，向每个孔中加入 250 微升新鲜的 Z 条件培养基，并通过轻柔吹打混匀悬液。将培养板再次在相同条件下孵育，并在再培养一天后重复此扩增操作。在此阶段的第三天和第四天，可观察到神经球的尺寸逐步增大。

开始传代时，在第四天，从每个孔中移除 250 微升培养基，但不要移除神经球。然后使用 1 毫升移液枪在剩余的培养基体积中对神经球进行机械性解离。接着，将每个解离孔中的细胞悬液合并。随后用血细胞计数板对细胞进行计数，并将含有 800 个细胞/微升的 250 微升原代培养上清液分配至新的 24 孔板的每孔中。继续向每孔加入 250 微升 Z 条件培养基，然后按照先前所述条件培养该板。