斑马鱼神经干细胞原代神经球的产生和分化

从含有富含生长因子的生长培养基的多孔板开始。

接种斑马鱼神经干细胞的单细胞悬浮液并孵育。

最初，干细胞利用生长因子并增殖。

去除碎屑并加入新鲜培养基，以促进细胞持续增殖和自发聚集，形成自由漂浮的原代神经球。

接下来，将神经球转移到含有生长培养基的新鲜孔中。

相同条件下孵育以诱导神经球的逐渐扩张。

反复移液以机械地将神经球解离成小簇。

接下来，将它们转移到涂有良好涂层的细胞外基质上，以促进它们的粘附。

含有胰岛素的无生长因子分化培养基代替生长培养基。

生长因子的缺乏和胰岛素的存在会刺激细胞分化为神经胶质细胞和具有神经元投射的神经元。

为了准备神经球的生成，用 300 微升新鲜的 Z 条件培养基填充 24 孔板的每个孔。然后，向每个孔中加入 200 微升细胞悬液，以每微升约 500 个细胞的密度接种它们。然后，将板在 30 摄氏度下在 5% 二氧化碳中孵育。

培养一天后，在显微镜下观察 24 孔板中的细胞。预计在此阶段观察到单细胞悬浮液。如果发现任何碎屑聚集在孔的中心，请通过移液约 100 微升培养基将其去除，并通过添加 100 微升新鲜的 Z 条件培养基来替换这种液体。去除所有碎屑后，在前面描述的条件下孵育板。

再培养一天后，将 250 微升细胞悬液从单个孔转移到新的空孔中。对所有 24 个孔重复此步骤。然后，向每个孔中加入 250 微升新鲜的 Z 条件培养基，并通过轻轻上下移液使悬浮液均质化。在相同条件下再次孵育板，并在培养一天后重复此扩增过程。预计在此期间的第三天和第四天观察到神经球的大小逐渐增加。

要开始传代，四天后，从每个孔中取出 250 微升培养基，但不要去除神经球。然后使用 1 毫升移液器机械解离剩余培养基体积中的神经球。继续从每个解离孔中汇集细胞悬液。然后，用血细胞计数器计数细胞，并将每微升含有 800 个细胞的 250 微升原代培养上清液分配到新的 24 孔板的每个孔中。继续向每个孔中加入 250 微升 Z 条件培养基，然后如前所述孵育板。