从大鼠脑组织中分离和培养小胶质细胞的无血清培养基方法

取一个灌注过的大鼠脑，将其切碎成小片段。

在缓冲液中匀浆组织以释放细胞，包括小胶质细胞。

待未消化的组织沉降后，收集含有细胞的上清液，并加入髓鞘分离缓冲液。

混匀内容物，并离心以分离细胞与髓鞘及碎片。移除髓鞘-碎片层及上清液。

用缓冲液重悬细胞，并用移液器吹打分散团块。

将悬液通过滤网过滤，以去除残留的细胞团块。

将过滤后的细胞转移至包被有小胶质细胞特异性单克隆抗体的培养板中。孵育以促进小胶质细胞黏附。

用缓冲液洗涤以去除非贴壁细胞。加入胰蛋白酶并孵育，使小胶质细胞脱落。

去除胰蛋白酶。

加入无血清培养基。置于冰上孵育，以减弱细胞与基质间的相互作用。

用移液器吸取悬浮液并收集到离心管中。离心后弃去上清液。

用无血清培养基重悬小胶质细胞，并接种至胶原蛋白包被的多孔板中。孵育以促进小胶质细胞贴壁。

加入含有生长因子和脂质的培养基。孵育以促进小胶质细胞成熟。

将脑组织在冰冷的DPBS中收集后，置于冰上的培养皿中，用冰冷的解剖刀将每个脑组织切成边长约1立方毫米的小块，转移至预冷的Dounce匀浆器中，并加入5至7毫升冰冻的匀浆缓冲液。接着，使用松配合的Dounce匀浆器，轻轻进行10至20次不完全的匀浆操作，以解离组织。注意不要在匀浆器底部直接碾压组织，而应通过匀浆器壁与活塞之间的间隙推动组织，使其分散。

为了保持小胶质细胞的活性，使用Dounce匀浆器进行多轮缓慢匀浆处理非常重要。

随后，小心移除活塞，以避免引入气泡。让解离不充分的组织块沉降到匀浆器底部，将上清液转移至新的预冷的 50 毫升锥形管中。接着，用新鲜的Dounce缓冲液补充所移除的体积，并重复解离步骤，共进行三到四轮，或直至所有组织完全解离。

在此步骤中，向含有细胞悬液的50毫升锥形管中加入预冷的douncing缓冲液，并将总体积调整至33.5毫升。接着，向细胞悬液中加入10毫升MSB，通过反复倒置管子数次以充分混匀。最终在43.5毫升体积中获得23%的MSB终浓度。

随后，在 4 摄氏度条件下以 500 g 离心 15 分钟，刹车速度调至缓慢。然后，用移液器小心吸除上层的髓鞘、碎片及上清液。在移除上层物质时需格外注意，确保尽可能彻底地去除。

随后，将细胞沉淀重悬于 12 毫升的洗脱缓冲液中。轻柔吹打细胞悬液，以分散任何残留的细胞团块。在此步骤中，将细胞悬液通过 70 微米细胞滤网，以去除大块碎片或细胞团。用 DPBS 清洗 OX42 包被的洗脱培养皿三次。每次清洗之间切勿让培养皿完全干燥。

倒掉最后一次 DPBS 洗涤液，将过滤后的细胞悬液加入平皿中。轻轻摇晃平皿使细胞分布均匀。然后将平皿置于室温下的水平面上孵育 20 分钟，以使细胞贴壁。孵育时间不得超过 20 分钟，否则细胞将难以从平皿中回收。随后，用 DPBS 冲洗平皿 10 次，以去除未贴壁的细胞。

小胶质细胞会牢固地贴附在培养板上，因此每次清洗时需轻轻晃动培养板，以确保去除其他非贴壁细胞。倒出最后一次的DPBS洗涤液，加入15毫升DPBS和200微升胰蛋白酶。

为了消化细胞，在37摄氏度下孵育培养皿，时间不超过10分钟。消化10分钟后，小胶质细胞仍会附着在培养板上。倒出混合液，并用DPBS轻轻洗涤培养板两次，以去除胰蛋白酶。随后，加入12毫升冰冻的MGM培养基。

随后，将平皿置于冰上放置两分钟，以减弱细胞与基质之间的相互作用，并确保平皿放置平稳，防止平皿局部区域干燥。之后，使用10毫升移液管和移液控制器在高速下剧烈吹打，以回收平皿中的细胞。利用移液管的液流绘制一个16×16的网格，尽量将所有细胞吹打下来。

在细胞总回收率与培养物的健康状态之间找到平衡至关重要。反复将细胞上清液在包被培养皿上进行吹打会导致培养物的活力下降。

在20倍显微镜下观察细胞，确保其已从培养皿上脱落。在培养皿表面标记细胞粘附的位置，并在这些区域重复吹打。收集细胞悬液，将3至4毫升上清液分装至每支15毫升锥形管中。在4摄氏度条件下，以500 g离心15分钟，使用慢速刹车。

孵育15分钟后，吸走上清液，每管中保留0.5毫升MGM培养基与细胞沉淀。随后，将各管中的沉淀用剩余的MGM培养基重悬，并合并所有管中的细胞。之后，使用血细胞计数板对细胞进行计数。

现在，将15 µL的IV型胶原蛋白直接点样于24孔阴离子、阳离子包被的组织培养板中央，于37°C孵育15分钟。使用血细胞计数板计数细胞后，用MGM将细胞稀释至2.3 × 10^-5/mL。吸除IV型胶原蛋白点样液，立即在该点样位置接种15 µL细胞悬液，使每点细胞数为3.5 × 10³个。

接着，在37摄氏度下孵育5至10分钟，以使细胞贴壁。然后，轻轻向孔中加入500微升已用CO₂平衡的TIC。