使用无血清培养基从大鼠脑中分离和培养小胶质细胞

以灌注的大鼠大脑为例。将其切成小块。

缓冲液中均质组织以释放细胞，包括小胶质细胞。

一旦未消化的组织沉降，收集含有细胞的上清液并添加髓鞘分离缓冲液。

混合内容物并离心以将细胞与髓磷脂和碎片分离。去除髓鞘碎片层和上清液。

细胞重悬于缓冲液中并移液以分离团块。

悬浮液通过过滤器以去除剩余的细胞聚集体。

过滤后的细胞转移到涂有小胶质细胞特异性单克隆抗体的培养板中。孵育以促进小胶质细胞粘附。

用缓冲液洗涤以去除非贴壁细胞。加入胰蛋白酶并孵育以松散小胶质细胞。

去除胰蛋白酶。

添加无血清培养基。在冰上孵育以削弱细胞-底物相互作用。

液并将悬浮液收集在管中。离心并除去上清液。

将小胶质细胞重悬于无血清培养基中，并转移到胶原蛋白包被的多孔板上。孵育以促进小胶质细胞粘附。

添加含有生长因子和脂质的培养基。孵育小胶质细胞成熟。

冷DPBS中收集大脑后，用冷手术刀刀片在冰上的培养皿中将每个大脑切成一立方毫米的块，然后转移到冰冷的Dounce均质机中，并用5至7毫升冰冷的douncing缓冲液。接下来，使用松散的 Dounce 均质器以 10 到 20 次轻柔和不完整的抚摸来解离组织。注意不要直接压碎均质机底部的组织。相反，推动组织穿过活塞和均质器两侧之间的空间。

重要的是通过多轮 douncing 缓慢均质化组织以保持小胶质细胞的活力。

然后，小心地拆下活塞，以防止引入气泡。让解离不良的组织块沉降到均质器的底部，并将上清液转移到新的、冷却的 50 毫升锥形管中。随后，用新鲜的 douncing 缓冲液替换去除的体积，并重复解离过程总共三到四轮，或直到所有组织都解离

在此过程中，将冰冷的 douncing 缓冲液添加到含有细胞悬液的 50 毫升锥形管中，并将总体积调整为 33.5 毫升。接下来，将 10 毫升 MSB 添加到细胞悬液中，并通过倒置管数次彻底混合。这将导致 23% 的 MSB 最终浓度为 43.5 毫升。

之后，在4摄氏度下以500g离心细胞15分钟，缓慢制动。然后，用移液器去除顶层髓磷脂和碎屑以及上清液。移除顶层时要小心，以确保尽可能多地去除顶层。

之后，将细胞沉淀重悬于 12 毫升淘金缓冲液中。轻轻研磨细胞悬液，以分解任何剩余的细胞团块。在此步骤中，将细胞悬液通过 70 微米的细胞过滤器以去除大碎片或细胞团块。用DPBS冲洗OX42涂层的平移皿3次。不要让板子在两次洗涤之间完全干燥。

掉最后一次 DPBS 洗涤液，并将过滤后的细胞悬浮液涂在平移皿上。轻轻旋转板以分布细胞。然后，将板在室温下在平面上孵育20分钟，以使细胞粘附。孵育时间不要超过 20 分钟，否则细胞将变得非常难以从培养皿中恢复。然后，用DPBS冲洗平移皿10次，以去除非贴壁细胞。

小胶质细胞将牢固地附着在板上，因此每次冲洗时旋转板以确保去除其他非粘附细胞。倒掉最后一次 DPBS 洗涤液，并用 15 毫升 DPBS 和 200 微升胰蛋白酶代替。

要对细胞进行胰蛋白酶消化，请将培养皿在 37 摄氏度下孵育少于或等于 10 分钟。胰蛋白酶消化10分钟后，小胶质细胞仍会粘在板上。倒出混合物，用DPBS轻轻清洗板两次，以去除胰蛋白酶。然后，用 12 毫升冰镇的米高梅代替。

随后，将平底锅放在冰上两分钟，以帮助削弱细胞和底物的相互作用，并确保平底锅平坦，以防止平底锅的区域变干。之后，用10毫升移液器和移液器控制器高速用力移液，从淘气皿中回收细胞。用移液器中的液体流绘制一个 16 x 16 的网格，以尝试去除所有细胞。

整体细胞恢复和培养物健康之间找到平衡非常重要。在淘金皿上重复移液细胞上清液将导致培养物的活力降低。

在显微镜下以 20 倍放大倍率检查细胞，以确保它们已从板上分离。标记培养皿顶部细胞卡住的点，并在这些区域重复移液。收集细胞悬液，并在每个 15 毫升锥形管中等分 3 至 4 毫升上清液。在 15 摄氏度下以 500 克旋转 4 分钟，缓慢制动。

15分钟后，吸出上清液，留下0.5毫升MGM与细胞沉淀。然后，将每个沉淀重悬于剩余的 MGM 中，并从所有试管中汇集细胞。之后，用血细胞计数器对细胞进行计数。

现在，将 15 微升胶原蛋白 IV 涂层直接铺在 24 孔阴离子、阳离子包被的组织培养板的中心，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。用血细胞计数器计数细胞后，在MGM中将它们稀释至每毫升2.3 x ^10-5。吸出胶原蛋白IV点，并立即将15微升细胞悬液接种到该点，每个点产生3.5 x 10³个细胞。

接下来，在 37 摄氏度下孵育 5 到 10 分钟，让细胞粘附。然后，轻轻地将 500 微升 CO₂ 平衡的 TIC 添加到孔中。